服务于微生物组结构解析的2b-RAD简化基因组方法学研究

Current strategies for decoding the taxonomical structure of microbiome have a number of limitations: 16S/18S/ITS amplicon sequencing suffers from amplification bias and the low resolution (at the level of genus or species), while shotgun sequencing suffers from high cost. Besides, usually both are inefficient for analyzing trace DNA. To tackle these challenges, we propose a new method called 2b-RAD metagenomic sequencing, which dramatically reduces sequencing cost, elevates the resolution to the level of isolates and improves sensitivity of analysis. Specifically, the total genome DNA of microbiota was processed by 2b-RAD, which includes digestion by the IIB enzyme, amplification and sequencing of the restriction fragments; then the reference genomes were used to deduce the taxonomical structure of microbiota. To validate 2b-RAD metagenomic sequencing, we will: (1) investigate, by in silico of enzyme restriction, the influence of the source, similarity and complexity of microbial genomes on the qualitative and quantitative results of 2b-RAD metagenomic sequencing, in order to solve the problem of interference of sequence mapping by highly repetitive short DNA fragments. (2) validate the sensitivity, reproducibility, resolution, accuracy and bias of 2b-RAD metagenomic sequencing, so as to evaluate and gauge its potential and limitation. This new method should reduce sequencing cost per microbiota by a factor of 10 to 100 and be able to tackle low-amount DNA, while maintaining the accuracy of deduced microbiota structure, thus will bring a series of new applications.

目前针对菌群结构的测序技术中，16S/18S/ITS扩增子测序存在显著的扩增偏好性，且一般只能分辨到属或种水平，而鸟枪法测序成本高昂，此外两者都缺乏有效应对痕量DNA的能力。针对这些局限性，我们提出2b-RAD宏基因组测序，通过降低总DNA序列的冗余度，大幅削减测序成本，将分辨率提高到株水平，且提高测序灵敏性：首先利用2b-RAD技术处理菌群总DNA样本，对IIB酶切片段进行扩增和测序，然后以微生物基因组为参考以推断菌群结构。为了验证2b-RAD宏基因组测序，我们将（1）通过模拟酶切数据，研究不同来源、相似度或复杂程度以及不同实验方法学对菌群定性和定量分析的影响，并解决高重复性短片段DNA干扰序列匹配的问题；（2）通过人工和自然菌群样本，验证2b-RAD宏基因组测序的性能如敏感性、重复性、分辨率、准确度和偏好性等，进而探讨其潜力和局限性,最终建立2b-RAD宏基因组测序技术。

近年来菌群与人体健康的关系被彻底重新定义，这离不开使用宏基因组测序解析菌群的物种组成。然而传统的宏基因组测序方法（例如扩增子和鸟枪宏基因组测序）无法很好的应对具有低微生物量、高宿主DNA污染、或严重DNA降解的微生物组样本。为了应对这些挑战，我们开发了“2bRAD微生物组测序”（简称2bRAD-M），它利用IIB型限制性内切酶对样本中的微生物DNA酶切产生25-33bp（取决于对不同酶的选择）的等长DNA片段，进而用于宏基因组的建库和测序过程。为了证明2bRAD-M解析菌群的物种组成的可行性，我们利用模拟的测序数据集、人工合成菌群和真实菌群样本对其表现进行了系统性的评估。其中模拟测序数据和人工合成菌群的测序结果表明，即使2bRAD-M通过简化基因组的方法仅对1%的宏基因组进行测序，仍能够准确解构痕量微生物样本，比如：（1）总DNA仅为1pg的微生物样本；（2）含有99%宿主DNA污染的微生物样本，以及（3）DNA仅为50bp的高度降解的微生物样本。而真实菌群样本如粪便、皮肤和环境表面的测序结果进一步表明，2bRAD-M可以准确的在种水平还原细菌、古细菌和真菌的物种构成。我们进一步将2bRAD-M应用于临床场景中，发现2bRAD-M可以分析福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本中原本难以测序的微生物组，比如我们基于2bRAD-M所提供的宫颈FFPE样本的物种结构，以91.1%的准确率区分了健康、浸润前、和浸润后宫颈癌组织。除此之外，我们发现与鸟枪宏基因组测序相比，使用2bRAD-M可以节省大量测序成本，比如2bRAD-M只需要鸟枪宏基因组测序深度的1~5%即可还原同等精度的菌群物种结构，从而将测序成本降低数十倍。2bRAD-M技术的成功开发，对于拓展微生物组研究的边界至关重要，在临床检测痕量微生物样本方面具有极大潜力。