药用真菌猪苓菌丝形成菌核差异基因及功能的研究

Polyporus umbellatus is one of the most widely used and precious medicinal fungi, which has been used to treat many diseases such as edema and acute nephritis for more than two thousand years. However, wild sclerotia of P. umbellatus are almost in danger of extinction due to unrestricted commercial harvesting, ineffective protection, and severe habitat destruction. .This study is conducted to analyze expressed sequence tags (ESTs) data based on suppressive subtractive hybridization cDNA library of P. umbellatus sclerotia and hyphae which has been successfully constructed. Then gene expression of oxidative stress and signal pathways which are probably associated with P. umbellatus sclerotia forming from hyphae will be detected by real-time quantitative fluorescence polymerase chain reaction (PCR). Full-length genes will be cloned by means of RACE. At last, Fuctional verification of genes associated with P. umbellatus sclerotial formation will be conducted..This study will provide us for gene expression characteristics in uncovering growth and development in P. umbellatus. On the other hand, it will help us to understand mechanisms of sclerotial formation and serve as a basis for implementing mass production of P. umbellatus.

猪苓是一种珍贵的药用真菌，其菌核入药，猪苓菌核在我国用药已达两千多年的历史。然而，随着猪苓菌核药用范围和用量的扩大，加上野生猪苓菌核资源的商业采挖以及缺乏有效的保护，使得猪苓菌核的生境遭受严重破坏，野生的猪苓菌核资源濒临枯竭。.本项目研究内容包括：通过成功构建的猪苓菌丝形成菌核抑制差减杂交cDNA文库，对表达序列标签进行数据分析；利用实时荧光定量PCR技术分析与氧化应激、信号转导途径等相关基因响应猪苓菌丝形成菌核过程中的基因表达分析；利用RACE技术克隆全长基因，并对猪苓菌核形成相关基因进行初步的功能验证。.上述研究工作的开展，不仅为揭示猪苓菌生长发育规律的基因表达特征奠定基础，同时为解析猪苓菌核形成及对药用真菌猪苓菌核的人工栽培工作提供理论依据。此项工作不仅具有重要的理论意义，而且具有潜在的应用价值。

猪苓是一种珍贵的药用真菌。然而，猪苓菌核目前处于濒危状态，猪苓菌丝形成菌核关键技术及形成机理成为制约猪苓菌核人工栽培技术的主要瓶颈。本项目通过成功构建的猪苓菌丝形成菌核抑制差减杂交cDNA文库，对表达序列标签进行数据分析；利用实时荧光定量PCR技术分析与氧化应激、信号转导途径等相关基因响应猪苓菌丝形成菌核过程中的基因表达分析；利用RACE技术克隆全长基因，并对猪苓菌核形成相关基因进行初步的功能验证。研究发现，在成功构建容量为1314个克隆的猪苓菌丝形成菌核的差减杂交cDNA文库基础上，共获得大于100bp的有效序列1202个。利用Cap3进行聚类拼接后，共获得746个一致序列，包括222个contigs和524个singletons。从文库中鉴定到丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）、GTP结合蛋白、依赖于钙调素的蛋白激酶等参与信号传导的基因、NADPH氧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、半胱氨酸过氧化物酶的相关序列，以及细胞凋亡抑制因子等相关序列。在猪苓菌丝形成菌核的SSH文库中选取了55个候选基因，采用SYBR Green I荧光定量PCR方法对候选基因进行了表达验证。其中表达上调的基因序列46个，下调表达的9个，上调表达序列中大于2倍的36个。对氧化应激相关基因在菌丝形成菌核过程中的转录水平进行分析，菌核中氧化酶相关基因的表达量远高于菌丝组织，而过氧化物酶基因在菌核中低表达。细胞信号相关基因在菌核中的转录水平均高于未形成菌核的菌丝组织，这些基因分别编码G蛋白、small GTPase类、蛋白激酶等。从猪苓中克隆得到新的NADPH氧化酶、乙二醛氧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和半胱氨酸过氧化物酶全长cDNA、 MAPK基因、4个小G蛋白基因、溶血素全长cDNA以及3个新的编码疏水蛋白的全长基因。NADPH氧化酶特异性抑制剂不仅使猪苓菌丝生长明显减缓，且不能成功诱导菌核形成，同时明显抑制猪苓菌丝细胞内ROS含量。草酸作为抗氧化剂能够抑制猪苓菌核的形成。MAPK抑制剂（PD98059）或Ras抑制剂FTI-277的应用能够明显抑制猪苓菌丝形成菌核，qRT-PCR分析显示MAPK或Ras基因的表达量与不使用抑制剂的对照组相比明显降低。上述研究结果为揭示猪苓生长发育的基因表达特征以及猪苓菌丝形成菌核的分子机理奠定基础，同时为猪苓菌核的栽培工作提供理论依据。