TLRs信号通道对Hh-LPS致肝细胞线粒体蛋白质组影响的分子机理

肝螺杆菌内毒素(Hh-LPS)可导致肝细胞损伤,其必须通过肝细胞TOLL样受体介导。我们新近的研究表明：Hh-LPS对敲除TOLL受体2基因的肝细胞损害显著减少，但并不能完全阻断Hh-LPS对肝细胞的作用。本研究在原来的基础上应用RNA干扰技术、比较蛋白质组学技术、western blot等方法研究：①siRNA阻断TOLL受体2.4信号通道对Hh-LPS致肝细胞线粒体蛋白质组变化的影响；②稳定表达TOLL样受体2、4基因对Hh-LPS致肝细胞线粒体蛋白质组变化的影响；③筛选及鉴定差异表达的蛋白质，并对其进行特异性验证。本研究如获预期结果，发现肝细胞线粒体蛋白质组中一些具有信号作用的分子，可进一步阐明Hh-LPS对肝细胞线粒体损伤的蛋白质组变化的影响，从TOLL样受体水平探讨防治Hh-LPS肝细胞线粒体的损伤。

本课题应用细菌培养技术提取Hh-LPS；采用细胞免疫法检测肝细胞表面TOLL 样受体蛋白质表达情况；采用RNAi技术获得敲除TOLL样受体TOLL-2、TOLL-4基因稳定生长的肝细胞。比较不同浓度的Hh-LPS、Hh死菌、Hh活菌及阿霉素（AD）在不同时间对正常的肝细胞以及敲除TOLL-2、TOLL-4样受体后的肝细胞生长影响，结果发现Hh-LPS、Hh活菌和AD对肝细胞生长、增殖、凋亡有不同程度的影响。应用蛋白质组学技术构建肝细胞、敲除TOLL样受体2、4基因肝细胞的线粒体蛋白质双向电泳图谱；应用质谱分析、微量蛋白质末端测序和生物信息学寻找差异表达的蛋白质点，筛选出Hh-LPS通过TOLL样受体信号通路影响肝细胞线粒体蛋白质组变化差异蛋白质，发现CHK1、ATM、CyclinA、CyclinB、CyclinD、CyclinE、PCNA等蛋白与细胞的增殖、凋亡密切相关。