miR-137调控多发性骨髓瘤组蛋白甲基化途径中EZH2和LSD1表达的机制研究

microRNA（miRNA）是一类大小约22个核苷酸的非编码RNA分子，可以通过与靶基因mRNA的特定位点结合，抑制该蛋白的合成或诱导该mRNA的降解，从而参与基因的表达调控。研究表明miR-137能够作用于组蛋白甲基化酶EZH2及组蛋白脱甲基化酶LSD1，调控组蛋白甲基化过程。多发性骨髓瘤（MM）迄今为止仍然是一种难治性疾病，发病机制不明。前期研究证明MM中存在组蛋白甲基化水平的异常升高，抗肿瘤药能够通过作用于组蛋白甲基化酶和脱甲基化酶，引起相应组蛋白甲基化水平的降低。本课题拟通过检测miR-137在MM中的表达及其与EZH2及LSD1、组蛋白甲基化以及相关抑癌基因间的相互作用，并通过基因转染技术使miR-137过表达，进一步研究其对MM细胞增殖、周期、分化、凋亡，组蛋白甲基化/脱甲基化及其下游途径的影响，试图揭示表观遗传学针对MM的新的调控路径，寻求新的MM的治疗靶点。

以人多发性骨髓瘤RPMI8226和U266细胞为研究对象, 以及磁珠分选法分选MM患者及非MM患者的骨髓单个核CD138+细胞为研究对象，Taqman real-time PCR法检测细胞内miR-137的表达情况；双荧光素酶报告基因法对miR-137的靶点进行验证；慢病毒转染法转染MITF-shRNA以及过表达miR-137，MITF；Real-time PCR法检测MITF，c-MET，P53的mRNA表达变化；Western blot或免疫荧光法检测MITF，c-MET，AKT， P53，p-AKT及其下游磷酸化蛋白的表达；MTT法和流式细胞术凋亡检测分析转染前后MM细胞的地塞米松敏感性；用慢病毒转染法转染MITF-shRNA以及过表达miR-137，MITF； Western blot法检测MITF，c-MET，AKT，p-AKT，p-mTOR，p-Beclin1，LC3 II的表达；免疫共沉淀（co-IP）法检测p-Beclin1与14-3-3蛋白和Vimentin蛋白的结合。实验表明miR-137在RPMI8226和U266细胞内未检测到表达，在MM患者骨髓单个核CD138+细胞的表达显著低于非MM患者骨髓单个核CD138+细胞；双荧光素酶报告基因实验提示MITF是miR-137的一个靶点；转染miR-137或MITF-shRNA后，MITF，c-MET，p-AKT及其下游磷酸化底物蛋白表达明显下调，AKT的表达无明显变化，P53表达明显上调，同时，地塞米松对MM细胞的36h抑制率及其诱导的MM细胞凋亡率均明显上调；在转染了miR-137的MM细胞内过表达MITF，可以逆转上述变化, 即miR-137可以引起MM细胞内MITF及其下游c-MET的表达下调，进而使AKT的磷酸化水平下调，从而提高了MM细胞对地塞米松的敏感性。转染miR-137或MITF-shRNA后，AKT的表达无明显变化，MITF，c-MET，p-AKT，p-mTOR，p-Beclin1表达明显下调；转染miR-137或MITF-shRNA后，LC3 II在基础情况下有少量增多，在饥饿诱导时显著增多；在转染了miR-137的MM细胞内过表达MITF，可以引起MM细胞内MITF及其下游c-MET的表达下调，AKT的磷酸化水平下调，从而促进MM细胞的自噬。