性早熟阴虚火旺证与GnIH-GPR147和Kisspeptin-GPR54信号通路功能紊乱的关系及中药的调控作用

Precocious puberty is one of popular endocrine disorders in children, with the incidence of 0.6% throughout the world. It is well known that the pathogenesis of early pubertal maturation in idiopathic precocious puberty(IPP) finally appears the higher-pulsatile release of hypothalamic gonadotropin releasing hormone(GnRH),induce early activation and hyperfunction of hypothalamus-pituitary-gonad axis (HPGA). Studies has proved the regulation of GnRH release.is asociated to two siginificant signal paths in hypothalamic: GnIH and their recepter GPR147 or Kisspeptin and their recepter GPR54.In order to observe the relation between precocious puberty and GnIH/GPR147 or kisspeptin/GPR54, to prove the abnormal expression of GnIH/GPR147 and kisspeptin/GPR54 is the material basis of "dificiency of shen-yin, hyperfunction of ministerial fire" in IPP.female Sprague-Dawley precocious puberty model induced by danazol will be used to study the developmental expression of hypothalamic kisspeptin/ GPR54mRNA and protain, GnIH /GPR147 mRNAand protain,GnRHmRNA etal,by these methods of RT-PCR,Wester-blot and immunohistochemistry.In the mean time ,these model rats will be treated by the nourishing "Yin" removing"Fire" Chinese herb mixture,the chang of hypothalamic kisspeptin/ GPR54 and GnIH /GPR147 mRNA and protain,hormone of pituitary will be measured,the regualation of the nourishing "Yin" removing"Fire" Chinese herb mixture on hypothalamus-pituitary-gonad axis will be proved.?????.

阴虚火旺是性早熟主要病机和证型。下丘脑GnRH神经元提前激活启动下丘脑-垂体-性腺轴是性早熟主要的发病机制，而GnRH的合成与释放受多种神经递质及神经肽的影响。研究表明GnIH/GPR147和Kisspeptin/GPR54是调控下丘脑GnRH的主要信号通路，为明确该通路功能失衡与性早熟"阴虚火旺"证的关系，我们以达那唑诱导的雌性性早熟模型大鼠为研究对象，采集相关的中医症候及血液指标，观察性早熟模型大鼠与阴虚火旺证的相关性；采用分子生物学和免疫组化方法，观察性早熟大鼠青春发育进程中下丘脑GnIH-GPR147和Kisspeptin-GPR54信号通路的基因与蛋白表达,神经元及突触联结的变化，并以滋阴泻火中药进行干预，探讨GnIH-GPR147和Kisspeptin-GPR54两通路的功能紊乱与模型大鼠性早熟"阴虚火旺"证的辩证关系，丰富中医肾本质的内涵；明确滋阴泻火中药对其紊乱的调控作用。

目的:以达那唑诱导的雌性性早熟模型大鼠为研究对象，探讨下丘脑kisspeptin/GPR54、GnIH / GPR147信号通路在性早熟发病机制中的作用，观察滋阴泻火中药的调节作用。方法：3日龄SD雌性大鼠，随机分为正常组、对照组、模型组、中药组。于大鼠5日龄时，模型组皮下注射溶有达那唑的乙醇与乙二醇的混合液进行造模，15日龄开始，中药组予滋阴泻火中药治疗，分别于大鼠15、25、30、35、40日龄时处死，留取标本，观察性器官发育情况；采用ELISA法检测外周血中E2、FSH、LH水平；采用RT- PCR法和免疫荧光法检测下丘脑kiss-1、GPR54、GnIH、GPR147、GnRH的mRNA和蛋白表达。结果：模型大鼠青春期启动和性成熟时间较正常组和对照组显著提前；在25和30日龄时，模型大鼠外周血性激素水平、子宫系数均显著高于正常组和对照组（P<0.05）；在25日龄时，模型组大鼠下丘脑kiss-1、GnIH、GPR147mRNA、GnRH的mRNA及kisspeptin、GnIH表达显著高于正常组和对照组（P<0.05）；在30日龄时，模型组大鼠弓状核kisspeptin表达低于正常组和对照组（P<0.05）；在35日龄时，模型组大鼠Kiss-1、GnRH、GnIH、GPR147mRNA表达水平低于正常组和对照组（P<0.05）。中药治疗后性早熟大鼠的子宫、卵巢系数降低，外周性器官的发育有延缓；大鼠的GnIH mRNA的表达增加；中药组大鼠在30日龄时KISS-1mRNA表达与对照组、模型组相比明显降低（P<0.05），在25日龄时GPR54 mRNA表达明显低于对照组（P<0.05），在30日龄时GPR54 mRNA表达与模型组相比有明显降低（P<0.05）。结论：性早熟模型大鼠在青春期启动时下丘脑kiss-1的mRNA和kisspeptin表达显著上调，青春期性成熟时GnIH、GPR147mRNA表达明显下调，提示Kisspeptin可能是性早熟形成的启动因子，GnIH/GPR147信号通路对性早熟大鼠青春发育的进程和性成熟有促进作用，两者共同参与性早熟的发病过程。滋阴泻火中药能延缓性早熟大鼠的发育，对KISS-1/GPR54信号通路有下调作用，对GnIH/GPR147的表达有上调作用，说明滋阴泻火中药治疗性早熟有多靶点，多环节的效应。