TIGAR调节Trx1核转运影响放射敏感性的作用及其机制研究

In present study, we will concentrate on the metabolic characteristics of higher oxidative stress of tumor and the p53-induced glycolysis and apoptosis regulator (TIGAR) as the candidate to control the oxidative-redox state of tumor. In order to reveal how TIGAR regulate radiosensitivity of tumor, we will investigate the association of TIGAR and the nuclear translocation of thioredoxin 1(Trx1). By gain- and loss-of-function of TIGAR both in vitro and vivo, the production of ROS, the cell proliferation and apoptosis, and the Trx1/GST-P1 nuclear translocation after ionizing radiation will be analyzed using survival curve, flow cytometry analyses, western blotting and immunohistochemistry staining. Through analyzing of the TIGAR expression and the Trx1 nuclear translocation in clinic samples, the possibility of TIGAR as a prognostic marker will be discussed. In conclusion, by exploration the molecular mechanism of TIGAR-enhanced radiosensitivity, this study might provide a novel prognostic marker of cancer, as well as the theoretic and experimental foundation for the better clinic radiotherapeutic approaches through tumor metabolic pathways.

本项目拟从肿瘤组织高氧化应激的代谢特点出发，从细胞及动物整体水平针对性地选择p53诱导的糖酵解及凋亡调节蛋白（TIGAR）作为干预受照细胞氧化还原调节的靶点，以硫氧还原蛋白（Trx1）核转运调控为切入点，拟用辐射后细胞存活曲线、流式分析、蛋白免疫印迹、免疫荧光及免疫组化等技术，检测干预TIGAR表达对电离辐射后肿瘤细胞的ROS水平、增殖、凋亡、Trx1核转运及谷胱甘肽S转运酶（GST-P1）核定位的影响，深入探讨TIGAR影响细胞放射敏感性的机制。通过测定临床肿瘤标本的TIGAR表达与Trx1核转运水平，寻求TIGAR与肿瘤患者预后的相关性，分析TIGAR表达水平作为评价肿瘤预后指标的可行性。本项目所获得的研究成果将有助于揭示TIGAR影响肿瘤放射敏感性的主要机制，有望提供一种有效评价肿瘤预后的分子标志物，为人类肿瘤放射治疗中的代谢增敏向临床应用转化提供具有重要意义的理论基础和实验依据。

干扰TP53诱导的糖酵解及凋亡调节蛋白（TIGAR）表达能够增加人脑胶质瘤细胞的放射敏感性，但其机制尚不明了。本课题通过调节TIGAR的表达水平，研究了TIGAR对Trx1 核转运的影响及其在改变胶质瘤细胞放射敏感性中的作用，从而阐明TIGAR调节胶质瘤细胞放射敏感性的机制；通过建立人脑胶质瘤裸鼠原位种植模型，揭示了TIGAR作为胶质瘤放疗增敏靶点的可能性。重要结果：（1）干扰TIGAR 表达显著增加受照胶质瘤细胞内的活性氧（ROS）水平并导致受照细胞内NADPH水平耗竭；（2）电离辐射后细胞内Trx1可发生核转运，核转运的峰值时间为照后2 h，而干扰TIGAR表达可显著抑制受照胶质瘤A172、T98G细胞内的Trx1核转运；（3）氧化还原Western blot结果表明A172细胞受照后，胞浆内Trx1于照后0.5 h内被氧化，于照后8 h回复到还原状态，而干扰TIGAR表达可显著延缓细胞浆内Trx1的还原进程，胞浆内Trx1于照后8 h仍处于氧化状态，细胞核内Trx1的氧化还原进程与细胞浆内Trx1类似；（4）克隆形成试验的结果显示，野生型Trx1过表达可显著抑制TIGAR干扰引起的放射增敏效应，而增加TIGAR表达对Trx1突变型细胞的放射敏感性无显著影响，表明Trx1核转运在TIGAR调节胶质瘤细胞放射敏感性中发挥了重要作用。（5）免疫荧光实验的结果显示，受照A172 γ-H2AX的点状荧光在照后4 h内消失，而在TIGAR干扰组A172细胞内γ-H2AX点状荧光直到照后12 h依然存在，表明细胞内DNA损伤修复进程被显著延迟。与Western blot的结果相似，免疫荧光实验的结果显示受照A172细胞Trx1核转运的峰值时间为照后2 h，而TIGAR干扰组细胞内Trx1核转运则完全消失。在野生型Trx1过表达细胞中，干扰TIGAR表达导致的DNA损伤修复延迟与Trx1核转运抑制均得到了显著恢复；（6）通过TIGAR shRNA慢病毒基因治疗，证实了干扰TIGAR表达可增加荷瘤小鼠颅内胶质瘤的放疗敏感性。本课题的科学意义在于阐释了TIGAR调节胶质瘤细胞放射敏感性的机制与Trx1过度氧化及Trx1核转运被抑制密切相关。通过裸鼠原位模型，进一步在动物水平验证了抑制TIGAR表达对胶质瘤的放疗增敏作用，从而揭示了抑制TIGAR表达可作为肿瘤放疗增敏靶点的可能性。