利用microRNA在植物中进行病毒诱导的基因沉默研究

病毒诱导的基因沉默（VIGS）是一种快速高效的研究植物基因功能的工具，传统VIGS通常被认为通过多种混合siRNA起作用，因而该技术有一个显著的局限：可能导致非特异的基因沉默。microRNA是另一种可负调控基因表达的小RNA分子。通过过表达人工设计的microRNA基因有可能克服基因沉默的潜在非特异性；此外大量的植物内源microRNA已被鉴定和预测，但大多数功能不清楚；研究植物内源microRNA的功能的重要方法之一是过表达这些microRNA基因，目前过表达主要是通过植物转基因来实现的，而植物转基因耗时费力，在一些植物上极其困难。本研究拟利用植物DNA病毒发展病毒载体，并探索用病毒载体进行microRNA介导的基因沉默的可行性，一旦成功，将为快速特异地沉默特定基因和快速研究植物microRNA的功能提供新的工具。

miRNA在各种生物中的各类生物过程中都扮演着非常重要的角色。植物中的多个miRNA已经通过实验或者生物信息学的方法得到鉴定和预测。然而，由于缺少有效的遗传学研究工具，这些miRNA的功能大多都是未知的，因此，开发能快速有效研究miRNA功能的遗传学工具的需求就变得非常紧迫。我们在本课题的支持下首先开发了一个基于卷心菜卷叶双生病毒（Calcrv）载体，该载体既可用于在植物中表达内源miRNA，也可用于表达人工miRNA。我们运用该基于病毒的miRNA表达系统（MIR VIGS），证明了通过表达人工miRNA可以非常有效的在本生烟草中沉默PDS，Su，CLA1，和SGT1等基因。沉默SGT1导致了N基因介导的对TMV抗性的丢失。此外，我们还利用MIR VIGS系统异源过表达了miR156和miR165， 均产生了发育不正常的表型。异源过表达miR165还可诱导烟草叶片产生黄斑。由此，我们开发的MIR VIGS系统不仅可以用来沉默代谢和抗性相关的基因，也可以用于研究植物内源的miRNA。其次，我们对烟草脆裂病毒（TRV）进行改造构建了一个用来在植物中异源过表达RNA的载体。我们利用该载体表达miRNA的靶标模拟序列来沉默植物内源miRNA，并将该系统命名为病毒介导的miRNA沉默系统（VbMS）。在烟草中我们利用VbMS系统成功沉默了miR165/166和miR172，都出现了发育表型。而利用VbMS在番茄中沉默miR319使其复叶复杂度降低。以上结果表明，基于TRV的VbMS系统是一个功能强大的在植物中用于研究miRNA功能的工具。