基于微流控纸基芯片的高灵敏度现场核酸检测方法研究及应用

Point-of-Care nucleic acids testing (POC NAT) is essential to the prevention and control of infectious disease as well as the development of personalized medicine. However, the traditional detection of nucleic acids normally requires strict operational environments, including complicated equipments and well-trained professionals, and thus is extremely difficult to apply to POC settings. This proposal would target the critical issues of sample preparation and signal detection of NAT, take full advantage of microfluidic paper-based analytical device (μPAD), and delve into new methodology, technology and mechanism with regard to high-sensitive POC NAT. We propose a new methodology to achieve high-sensitive NAT on paper matrix by utilizing multiple hybridizations of branched DNA (bDNA) to amplify the signal of nucleic acids; a new technology to integrate FTA card with μPAD by using a removable hydrophobic membrane, and perform semiautomatic whole blood preparations, such as cell lysis, RNA collection and release, on μPAD; and reveal new mechanisms of NAT on paper by combining kinetics of hybridization and diffusion of nucleic acids. We would also study the influence of buffer constituents, temperature and time on the effectiveness and rapidity of hybridization; employ μPAD to detect one diagnosis marker of malaria (18S rRNA of parasite plasmodium) in whole blood. We hope that the implementation of this proposal would not only establish a μPAD technical platform and theoretical guide for performing high-sensitive POC NAT, but also promote wide applications of μPAD in clinical molecular diagnosis.

现场的核酸检测对于传染性疾病的防控和个体化医疗的发展具有十分重要的意义。但是核酸的传统检测方法对设备和操作要求较高，应用于现场有诸多困难。本项目拟针对检测灵敏度和前处理集成化等关键问题，充分利用微流控纸基芯片(μPAD)的特点和优势，系统研究和探讨高灵敏度现场核酸检测的新思路、新方法和新规律。本项目将重点提出适合纸基的高灵敏度核酸检测新思路，利用分支核酸(bDNA)技术的多重核酸杂交反应放大纸基上的核酸信号；提出利用疏水膜集成FTA elute卡的新方法，实现μPAD半自动全血前处理操作的集成化；结合动力学和扩散过程研究，揭示核酸杂交反应在纸基上的新规律。本项目还将研究缓冲液成份、反应温度、反应时间等对核酸杂交反应效率和速率的影响；检测全血中的疟疾诊断标志物(疟原虫18S rRNA)。本项目将为高灵敏度的现场核酸检测提供μPAD技术平台和理论指导，并促进μPAD在临床分子诊断中的广泛应用。

微流控纸基芯片是一种新颖的检测技术平台，具有改进现有临床诊断技术的巨大潜力，也有助于开发新型的床边快速诊断方法。因为微流控纸基芯片具有较小的检测区域和较高的比表面积，各种基于捕捉和扩散的反应过程会被加速。例如，原本数小时的检测可以在30分钟之内完成。微流控纸基芯片的其他优点还包括，检测通量的大幅提高，检测所需的试剂用量大幅减少，检测成本大幅降低，以及血清消耗的大幅下降。例如，纸基免疫检测芯片的检测区只需要数纳升血清。如此低的血清体积不仅可以减轻病人的负担，更有利于发展无创采血的临床检测方法。本项目首先发展了一种微流控纸基免疫检测芯片用于丙型肝炎HCV的临床诊断（Anal. Chem., 2014, 86, 5338）。该方法可以在降低检测成本和检测时间的同时，提高检测通量，即将初筛检测(酶联免疫吸附方法, ELISA)和确诊检测(重组免疫印迹法, RIBA)集成到一次检测中完成。因此，该方法提高了HCV的临床诊断效率，还有望推动对大规模人群的积极筛选和革新HCV的传统诊疗路径。更重要的是，该工作从诊断技术的角度提供了一种新的思路来应对未来十年全球性HCV爆发的挑战。本项目的另一项主要工作是发展了一种新颖的微流控纸基阴离子检测芯片用于囊性纤维化（Cystic Fibrosis, CF）的临床诊断（Chem. Commun., 2015, 51, 6365）。该芯片由数层纸基构成，重量轻盈，体积小巧，其形似创可贴，也可以粘附在皮肤表面，有助于消除汗液收集中的蒸发误差。此外，微小的尺寸大幅减小检测所需的汗液体积，只有1-2微升（传统方法的十分之一），有利于进行不易出汗人群如婴幼儿等的筛查诊断。该项工作重点发展了一种新的检测机制，即采用颜色变化来定量检测阴离子，以及相应的颜色处理方法。本项目注重研究工作的原始创新，同时勇于挑战难度较大的基础与临床结合的转化研究。本项目主要发展的两项工作内容被美国化学会、每日科学和分析科学家等数十个新闻媒体报道和转载，取得国际学界的一定反响。