耦合分子印迹技术的发根培养合成次生代谢物新技术

本项目一方面研究采用添加一定浓度的植物生长调节剂，利用农杆菌诱导子等方法影响喜树发根代谢，提高喜树发根体系中喜树碱等次生代谢物的分泌量。另一方面，基于分子印迹聚合物独特的选择性和亲和力,制备对喜树次生代谢物高选择性、高吸附性的分子印迹吸附材料，并利用分子印迹吸附剂直接从发根培养体系中提取次生代谢物，实现发根培养生物合成技术与分子印迹技术的有效耦合。以Ri质粒诱导为基础的发根培养，具有生长迅速、次生代谢产物稳定、代谢物分泌至培养基中等特点，是一条产生次生代谢产物新的有效途径。如何提高发根体系中次生代谢物的分泌量；高效提取、分离其培养基中的次生代谢产物是一急需探讨的课题。.本项目着重进行如下的创新性探索：1、发根培养生物合成技术与分子印迹技术耦合，形成反应和分离耦合技术，提高合成植物次生代谢产物的产出率；2、利用超临界C02流体中的沉淀聚合反应合成分子印迹聚合物。

喜树为中国特有树种，喜树碱系列衍生物抗癌药物是附加值极高的产品。Ri质粒诱导的发根具有生长迅速、激素自养、次生代谢产物含量稳定、不易变异等特点，而且可把代谢物分泌至培养基中。本研究用植物转基因工具发根农杆菌，对喜树进行基因干预，实现喜树药用价值次生代谢物的合成；用大孔吸附树脂完成离线分离富集工作，用化学计算指导分子印迹化合物的设计和合成，探讨喜树发根培养次生代谢物的原位捕抓和专一吸附；用细胞模型（黑色素瘤细胞）评价了喜树次生代谢物的药理活性，进一步阐明了相关物质的抗癌药用机理。本研究的工作总结如下：.1.建立了Ri质粒介导的喜树发根的培养体系：选择发根农杆菌种ATCC15834作为介导菌株；证实用无菌苗子叶进行发根培养,发根率最高, 发根农杆菌经液体培养至OD600为近0. 8, 稀释5倍用于接种感染喜树外植体；用 250mg/L羧苄青霉素+250 mg/L替漫汀抗菌；发根在含蔗糖30g/L 的HRIM培养基中生长较迅速，液体培养介质有利于喜树发根生长，选8小时光照条件，发根的PH范围以5.5-6.0为优。.2. 确定了喜树碱及羟基喜树碱的定量测定方法；毛状根的喜树碱含量0.022 mg.g-1（D.W）与正常根含量0.027mg.g-1（D.W）接近；30天培养基中喜树碱含量达根含量的近30%。.3. 用大孔吸附树脂离线分离富集培养基中次生代谢物，证实 HPD722树脂对喜树碱效果最好；动态参数是：氯仿/乙醇（1：1）作解吸液，解吸液PH值为3，上柱流速1.0ml/min,从培养基中提取了β-谷甾醇、喜树碱、羟基喜树碱；确定了金丝桃苷的存在。.4. 以与喜树碱含有相似官能团的茶碱为模板分子，制备了对茶碱有良好吸附能力的单分散或窄分散分子印迹聚合物微球，为喜树碱分子印迹微球的制备筛选了系列参数：GMA和DVB用量配比为4:6得到单分散的聚合物微球，微球的平均粒径为2.65µm；分子印迹聚合物微球的接枝量可以通过控制PGMA-DVB微球表面环氧基含量进行调整；当分子印迹聚合物的接枝量增大到12%时，其吸附量达到14µg/g。.5. 运用Gaussian 03程序包，采用密度泛函理论（DFT , Density Functional Theory）方法，对喜树碱分子和功能单体分子丙烯酰胺以及二者所形成的复合物的构象进行几何优化，在此基础上结合自然键轨道（NBO