内吞和胞内早期运输过程中磷酸肌醇分子的动态生成和转运转化研究

There are more than 1000 different lipid species in eukaryotic cells. The small size, fast diffusion and rapid metabolism of lipid species, and the lacking of appropriate labeling and imaging tools, has made it extremely difficult and challenging to visualize the precise distribution, trafficking and conversion of lipids in living tissues, cells and organelles. The developing of new labeling and imaging tools to directly visualize lipids in living cells and organelles is of critical importance. In this project, we are going to design new clathrin- or early endosome-specific phosphoinositide sensors and optimize the 2D/3D live-cell high-resolution imaging techniques for lipid imaging. By using multiple cutting-edge multidisciplinary approaches, this project will reveal systematically the dynamic distribution, trafficking and conversion of different phosphoinositide species during clathrin-mediated endocytosis and the dynamic formation of early endosomes. These new tools will also provide new strategies and tools for studying the intracellular trafficking and conversion of other lipid species.

真核细胞内存在超过1000种脂类分子，但由于脂分子尺寸小、扩散快、生成代谢迅速，同时适合活细胞脂分子研究的工具十分有限，使得在组织、细胞和亚细胞器等各个层面研究脂类分子的准确定位、动态转运、生成代谢和功能等极为困难，是脂类研究的重大挑战之一。通过开发新技术方法研究脂类分子在单细胞、亚细胞器的精确定位和动态分布，以及其分布或代谢异常导致疾病的分子机制，具有重要的意义。本项目中，以研究细胞膜上内吞囊泡生成至细胞内早期内体形成这一动态物质运输途径过程中磷脂类磷酸肌醇分子的动态生成和转运转化为出发点，以方法学创新为突破口，通过设计clathrin内吞囊泡和早期内体特异的新型磷酸肌醇分子探针，发展适合脂类分子的活细胞高分辨率2D/3D荧光成像技术，系统研究不同磷酸肌醇分子在内吞和胞内早期运输过程中的动态分布和转运转化，该研究也将为探索其他脂类分子在活细胞内的动态生成和转运转化提供新的研究策略和方法。

不同脂类分子在不同组织、细胞类型、甚至细胞器的分布和相对含量存巨大差异，脂类分布和代谢紊乱与心血管疾病、代谢性疾病、神经疾病和肿瘤等重大疾病密切相关。通过开发新技术和新方法，探索脂类分子在细胞和亚细胞器等层面的准确定位、动态转运、功能和生成代谢等极具挑战，也具有重要的生理和病理意义。本项目针对细胞膜上内吞囊泡形成至细胞内早期内体形成这一动态的物质运输途径，设计clathrin包被内吞囊泡和早期内体特异的磷酸肌醇等脂质分子探针，发展适合脂类分子的活细胞单分子成像技术，研究各种脂质分子在内吞和胞内运输过程中的动态分布和转运转换。本项目中，我们开发了磷酸肌醇分子PI(3,4,5)P3和PI(3,5)P2的新型分子探针，开发了内吞结构特异的PI(3,4,5)P3、PS、PA、DAG等脂质分子探针；建立了可用于脂类分子的单分子荧光标记体系，建立了适合脂类分子的单分子成像和分析平台，实现了对三种脂质分子同时标记和活细胞成像。在开发的新型脂类分子探针和成像平台的基础上，对多种脂质分子在内吞和早期内体形成过程中的动态分布和相互之间的转化进行了成像和定量分析，揭示了在内吞和胞内转运过程中脂质分子的动态转运转化规律。利用新的脂质分子探针，结合活细胞脂质成像和分析，对几种脂质分子在内吞和早期内体形成过程中的作用进行了分析，对调控脂质分子分布和转运转化的激酶和磷酸酶进行了分析鉴定。这些新的脂质分子探针和成像方法，为探索其他脂类分子在活细胞内的动态转运转化提供新的研究策略和方法，为未来研究脂质分布和代谢紊乱相关疾病的机制也提供了新的工具。