遗传杂交分析疟原虫子孢子入侵唾液腺相关基因及其功能研究

Malaria transmission-blocking vaccines are effective for controlling the spread of malaria in the crowd. We found that the sporozoites of Plasmodium yoelii NSM could not invade salivary gland, and the mosquitos infected with NSM could not transmit malaria anymore. This phenomenon is a fantastic model for the studies on transmission-blocking vaccines and drugs. In order to locate the functional genes and reveal molecular mechanism, we made the genetic crosses between NSM and BY265, a normal-type strain of P. yoeli. The progenies cloned from the cross will be genotyped with microsatellite markers and the phenotype of slaver gland invasion also will be evaluated. Then, the genetic analysis would lead to the identification of genetic loci and candidate genes, whose biological function will be verified with knockout and evaluation performed by Crispr-Cas9. This work will be helpful to design transmission-blocking vaccine aims at sporozoite stage. This kind of vaccine will kill the parasites in mosquito more effectively when work with the vaccine which effects on gametes period. This work will greatly promote malaria elimination process.

传播阻断类疫苗是预防疟疾在人群中传播的有效手段之一。课题组前期研究发现，约氏疟原虫NSM株因存在子孢子入侵唾液腺方面的缺陷，而丧失了通过蚊叮传播疟疾的能力。该现象为我们研究疟原虫子孢子在蚊体内发育提供了良好的模型，但目前对其中涉及的分子机理还不清楚。为研究子孢子入侵唾液腺的功能基因和分子机制，本研究拟用子孢子入腺正常型BY265株与缺陷型NSM株构建遗传杂交，通过克隆杂交子代、对杂交子代表型和基因型分析鉴定与之相关基因座位和候选基因，利用Crispr-Cas9技术对候选基因进行基因位点突变和基因敲除，验证基因功能。这将有助于我们设计针对子孢子阶段的蚊期传播阻断疫苗。该阶段疫苗与配子时期的疫苗联合使用，将使传播阻断作用覆盖疟原虫蚊期发育阶段的早期和晚期，更高效的阻断疟原虫在蚊体内发育，为实现消除疟疾目标提供新的思路。

传播阻断类疫苗和药物是预防疟疾在人群中传播的有效手段。本项目主要包括以下2方面内容：1）遗传杂交研究子孢子入侵唾液腺相关基因；2）蚊期疟原虫CSP蛋白逃避按蚊免疫识别。现分别讲两部分的工作进展阐述如下。.第一部分：遗传杂交研究子孢子入侵唾液腺相关基因：BY265亲本与NSM亲本杂交获得的遗传子代经基因型鉴定和表型分析后，进行了数量性状分析（QTL）；并通过疟原虫基因组数据库对遗传座位中的相关基金进行检索分析。已经鉴定出与该表型相关的三个基因座位，分别是染色体5（Chr5@24.0 cM和Chr5@4.0 cM）和13 (Chr13@22.0 cM)，共含184个预测基因。然而QTL分析中获得的LOD值都没有大于3，这说明三个座位的可靠性还须进一步研究。.第二部分：蚊期疟原虫CSP蛋白逃避按蚊免疫识别：我们对CSP蛋白的Pexll功能域突变虫株卵囊发育过程中出现的黑化现象的机制进行研究。结果表明：（1）CSP pexel 功能域突变对疟原虫在红内期、配子体时期、卵囊阶段、子孢子阶段发育并无明显影响。（2）按蚊体内免疫基因的表达变化是引起卵囊黑化的重要原因；通过转录组测序和RNAi等手段证实，按蚊TEP1基因是调控疟原虫黑化的主要因素。（3）免疫荧光及体外血细胞分化实验表明，CSP突变的卵囊周围可以募集活化的血淋巴细胞；体外的血淋巴子孢子刺激血细胞实验表明，CSP突变原虫能促进血细胞中TEP1的表达。.这些工作有助于我们设计针对卵囊和子孢子阶段的蚊期传播阻断疫苗。该阶段疫苗与配子时期的疫苗联合使用，将使传播阻断作用覆盖疟原虫蚊期发育阶段的早期和晚期，更高效的阻断疟原虫在蚊体内发育，为实现消除疟疾目标提供新的思路。