小麦及其野生近缘植物精氨酸酶基因克隆及分子特性分析

Arginase (ARG), widely involved in the process of nitrogen utilization in plants, is one of the key enzymes in maintaining homeostasis of nitrogen in wheat. Update, there is no report yet on the identification and characterization of ARG in wheat and its wild relatives. This study intends to identify ARGs and their promoter sequences from wheat and its wild relatives using in silico, blast, iPCR, and RACE methods, based on the recently released diploid and hexaploid wheat whole genome shotgun sequences in NCBI. Phylogenetic tree will be constructed to dissect genomic evolutionary mechanism based on ARGs sequence alignment among wheat and its wild relatives. Bioinformatics and transgenic strategy will be employed to assay expression in specific tissue, identify the core regulatory elements, and make clear their function in Arabidopsis transgenic lines of wheat ARGs. Copy number determination and chromosomal localization of wheat ARG will be performed via AS-PCR and Southern blot techniques. The ARG expression profiles will be made in wheat different tissues and under different abiotic stresses and low nitrogen supply to unravel the expression pattern and mechanism of response to stresses. The study will be theoretically and practically important to provide more gene resources for wheat genetically engineered breeding, promote the molecular dissection of wheat nitrogen metabolism, and provide more evidence for the evolution of the wheat genome.

精氨酸酶（arginase，ARG）广泛参与植物体内氮素利用过程，是维持小麦体内氮素动态平衡关键酶之一。目前小麦中该酶编码基因克隆及分子特性研究还没有报道。本研究拟根据克隆的ARG基因序列，以NCBI公布二倍体和六倍体小麦全基因组序列数据库为基础，通过in silico、blast、iPCR及RACE技术分离小麦及其近缘植物ARG基因及启动子序列；构建系统发育树，解析小麦及其野生近缘植物基因组进化机制；利用生物信息学及转基因技术，分析小麦ARG基因表达的组织定位、核心调控元件及转基因功能；通过AS-PCR及Southern blot技术，明确小麦ARG基因拷贝数及染色体定位；构建不同逆境、低氮胁迫及不同组织ARG基因表达谱，解析小麦ARG基因胁迫应答机制和组织表达特性。研究结果将为小麦基因工程育种提供更多基因资源，促进对小麦氮代谢调控过程分子机理认识，并为小麦基因组进化研究提供更多实证。

精氨酸酶（ARG）通过将精氨酸转化为鸟氨酸和尿素来促进氮的再利用。然而，小麦ARG基因功能尚未报道。本项目中，我们成功从小麦及其野生近缘植物分离到小麦ARG基因。对小麦基因组序列数据库检索表明，小麦野生近缘种中存在单拷贝ARG，而普通小麦基因组中存在3个拷贝，并通过实验首次将其定位到小麦第2染色体同源群的短臂上，即TaARG-2AS、TaARG-2BS和TaARG-2DS。小麦TaARGs序列分析显示，TaARG-2AS存在框内终止密码子，而其他两个基因能够编码完整蛋白。小麦TaARG-2BS及TaARG-2DS转录本具有遍在性，但以茎秆和叶鞘中TaARG-2BS的表达量最高，而叶中TaARG-2DS的表达量最高。两个基因在不同发育阶段表达趋势相似，在孕穗期和灌浆期达到峰值。TaARG-2BS转录本受高盐和干旱诱导，而TaARG-2DS仅在干旱条件下表达，但两者都属低温诱导型。此外，两个基因在白粉病抗感性品系Pm97033和宛7107中具有相似的表达模式，但在白粉病感染后72小时的Pm97033中大量诱导表达TaARG-2BS，而在感性品系宛7107中TaARG-2DS没有明显的转录产物。来自单子叶植物ARG具有更保守的线粒体靶向信号，并且比双子叶ARGs在进化上更保守。本研究利用来自化脓性链球菌的II型CRISPR/Cas9系统，通过农杆菌介导的转化技术，采用双靶点手段，成功实现ARG基因在普通小麦中敲除编辑。通过错误导向的非同源末端连接（NHEJ）DNA修复，得到每个TaARG同源基因多种编辑类型。通过T0和T1代基因型分析表明，该编辑类型可以稳定存在。对T1代不同编辑类型植株13个农艺性状分析，结果表明，敲除后代的籽粒蛋白含量明显增加，而主茎茎秆直径变小。研究结果暗示小麦TaARGs对小麦理想株型具有一定影响，对小麦籽粒蛋白质含量（GPC）有很大贡献。