肿瘤细胞核靶向p53基因聚酰胺-胺聚合物递送系统的研究

本研究旨在设计携载p53抑瘤基因的新型PAMAM递送载体系统，在高效传释DNA基因质粒的同时，实现增强目的基因转染和表达的主动靶向、内涵体逃逸和核定位三重策略，探讨载体转运、基因转染、蛋白表达及肿瘤抑制及凋亡的机制。.选择携带抑癌基因p53的真核表达质粒为模型基因，通过扩增、提取、纯化方法制备报告质粒样品；使用阳离子树枝状聚合物PAMAM为传递载体，分别引入二硫键和共价键的链接方式，在其表面进行PEG长循环修饰和叶酸配体的靶向修饰；以高迁移率族蛋白HMGB1作为核定位输入媒介，通过静电作用形成pDNA/HMGB1/PAMAM三元复合物。采用制剂学、材料学、细胞学、药动学、药效学等手段，对其开展结构、性质与功能研究，以期达到科学评价、发现规律、揭示本质的目的。.本课题研究的必要性和可行性强，理论意义与学术价值大，具有科学性、创新性、探索性，希望其能为治疗性基因递送系统研究提供有益的借鉴。

本项目在基于功能化载体PAMAM的基础上，设计并构建两种新型的集长循环、主动靶向、还原和pH敏感释药等功能于一体的聚合物递送系统，并分别以化疗药物与基因药物为模型，通过体内外实验考察载体的性质及抗肿瘤作用机制。.还原/pH双重响应与RGD修饰PAMAM靶向载药系统及其抗肿瘤作用机制研究。以4代的聚酰胺-胺阳离子树枝状大分子PAMAM为聚合物骨架材料，通过二硫键将聚乙二醇（PEG）连接在PAMAM的表面，合成不同PEG化程度的PAMAM-SS-PEG（PSSP）聚合物，进一步采用双功能化的HS-PEG5000-COOH偶联cRGDyK肽和PAMAM,合成RGD-PEG-SS-PEG-PAMAM（RGD-PSSP）聚合物，并通过TLC、1H NMR和FTIR对其进行了结构确证。在此基础上, 以阿霉素（DOX）为抗肿瘤模型药物,制备了RGD-PSSP/DOX复合物，并对复合物的制剂学特性、细胞毒性、细胞摄取、摄取机制以及荷瘤小鼠的体内抗肿瘤活性进行了研究。体外释放表明，RGD-PSSP/DOX具有明显的还原和pH敏感性;细胞毒性、细胞摄取及胞内的药物分布表明复合物在细胞内的pH/还原双敏促发药物释放。体内抗肿瘤实验结果表明，RGD-PSSP/DOX具有良好的抗肿瘤效果且显著降低DOX对小鼠的毒性。.新型pH敏感基因传递载体系统FA-PEG-CCTS/PAMAM /HMGB1/pDNA纳米复合物（FPCPHDs）的设计与构建。该系统具有延长体内滞留时间、肿瘤靶向、溶酶体逃逸及细胞核定位的能力，实现质粒DNA的高效转染和表达。该系统由质粒DNA（pDNA）、高迁移率族蛋白1（HMGB1）、4代PAMAM以及叶酸修饰聚乙二醇接枝的羧化壳聚糖（FA-PEG-CCTS）通过静电作用复合而成。其内部核心是PAMAM/HMGB1/pDNA三元纳米复合物（PHDs），该PHDs带正电荷，表面由带负电荷的FA-PEG-CCTS包裹。FPCPHDs对pDNA具有高效的压缩和保护作用，无明显的细胞毒性，且体外转染效率高。通过激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）对FPCPHDs的胞内转运行为进行了跟踪和定位。复合物在S180荷瘤裸鼠体内的组织分布及其表达情况表明FPCPHDs能够显著提pDNA在肿瘤部位的聚集、摄取以及基因的表达。