G蛋白偶联受体(Fogpr1-4)在尖孢镰刀菌发育和致病过程中的作用及机制

In several filamentous fungi, the heterotrimeric G protein signalling pathway is involved in development and pathogenesis. For example, in plant fungal pathogen such as Fusarium oxysporum, the G protein siganling mediated by Gα and Gβ were reported to regulate development, stress resistance and pathogenesis of the pathogen. But it remains a mystery which proteins sense environmental signals to activate the G protein signaling pathway, and which environmental signals they sense.In previous work, we explored 18 genes encoding G protein coupled receptors(GPCR) from the genome of Fusarium oxysporum f.sp. cubense(Foc). The phylogenetic tree based on the amino acid sequences showed that 4 GPCRs(Fogpr1-4) are clustered in one group containing the glucose receptor Gpr1 from Saccharomyces cerevisiae and the receptor GprD that controls the sexual development in Aspergillus nidulans, indicating that they may be invovled in regulating development and pathogenesis of Foc via G protein signaling pathway. To confirm the assumption, the assays containing the targeted gene-deletion, genetic complementation, and phenotype observation, will be taken to investigate the actions of the four GPCRs in the development and pathogenesis of Foc, and explore the signals they sense. Additionally, the interactions between the GPCRs and Gα or Gβ will be determined by yeast two hybrid assays to know how they function in G protein signaling pathway. The expressions of the development and pathogenicity-related genes will also be analysed by real time PCR to decipher their regulation mechansims. In the end, the results from the aforementioned investigations will aid us to understand the pathogenesis of Foc, and boarden the knowledge of its biology. More importantly, these may guide us for developing some new disease control strategies。

在一些丝状真菌中，G蛋白信号传导途径在发育和致病性等方面具有重要作用。尖孢镰刀菌Gα和Gβ亚基蛋白在发育、抗逆性和致病过程等方面具有调控作用，然而触发G蛋白信号传导途径的信号和受体仍是未知。在前期工作中，我们获得了18个尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白偶联受体（GPCR）编码基因，基于氨基酸序列的聚类分析表明其中4个（Fogpr1-4）与酵母葡萄糖感应受体Gpr1和构巢曲霉发育相关受体GprD在系统发生关系上较为接近，暗示它们可能通过G蛋白信号传导途径调控尖孢镰刀菌的发育和致病性。为验证这个假设，本项目拟通过基因删除、遗传互补等方法，探明这些GPCR在发育和致病性等方面的作用及其感知的信号；拟分析它们与Gα和Gβ蛋白的互作，以及下游发育和致病相关基因的表达，以明确它们调控发育和致病过程的详细分子机制。探讨尖孢镰刀菌GPCR调控发育和致病的分子机理，以期探寻作物枯萎病防治的新思路和新策略。

G蛋白信号传导途径在许多植物病原真菌中参与调控生长发育和致病性等生物学过程，研究发现G蛋白信号途径在尖孢镰刀菌中具有相似的作用。尽管如此，激活该信号途径的信号和受体仍是未知。本项目组通过生物信息学分析，发现香蕉枯萎病菌尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc）Fogpr1-Fogpr4这4个基因编码的假定G蛋白偶联受体与酵母的蔗糖感知受体gpr1及烟曲霉的毒力和发育相关的受体GprD等在序列上相似性较高，暗示这4个基因参与调控该病原真菌的发育和致病性。为验证这个假设，采用同源重组策略，分别敲除了Foc的Fogpr1-Fogpr4基因。这些基因敲除突变体在PDA上的生长均减慢，但在基本培养基以及其它碳源(麦芽糖、蔗糖、果糖等)替换葡萄糖的基本培养基上的生长均没有明显变化，表明受体参与调控Foc在PDA上的菌落生长。但Fogpr1-Fogpr4基因敲除突变体在菌落形态、产孢量及对巴西蕉（或粉蕉）的致病性均与野生型相当，表明Fogpr1-Fogpr4这些假定受体基因不参与Foc的发育和致病性。Fogpr1::GFP融合蛋白在营养丰富的培养基中主要定位在细胞质，而在营养贫乏的条件下，其主要定位在细胞膜，表明Fogpr1蛋白可能是个受体蛋白，可感知细胞周围的营养状况。此外，在酵母双杂系统中，预测的Fogpr1蛋白胞内肽段可与G蛋白α和β亚基互作，这表明Fogpr1可将感知的信号传递给G蛋白。由于G蛋白亚基编码基因在Foc中的具体功能仍未阐明，因此采用上述相同的方法研究了Foc的G蛋白α和β亚基基因的功能。 发现Gα亚基FGA1和Gβ亚基FGB1均参与调控Foc的生长、发育和致病性，而第二个α亚基FGA2主要参与调控致病性，第三个α亚基FGA3参与调控Foc的菌落生长。综上所述，Fogpr1-Fogpr4参与调控病原菌Foc菌落生长，但不参与发育和致病性。Fogpr1蛋白可能是一个G蛋白偶联受体，可感知细胞周围的营养状况，可与G蛋白亚基互作。而G蛋白α和β亚基在病原菌Foc的生长、发育和致病性中均有不同的作用。这些研究结果为揭示尖孢镰刀菌古巴专化型感知环境的分子机制奠定了基础，同时为该病害新型防治策略的制定提供了理论指导。