Apelin调节精氨酸加压素在体液平衡中的作用及机制研究

Apelin is colocalized with arginine vasopressin (AVP) in hypothalamic magnocellular neurons. Under the influence of osmotic pressure, apelin acts as a potent diuretic neuropeptide counteracting AVP actions through inhibition of AVP neurons activity and AVP release to maintain body fluid homeostasis. Apelin receptor (APJ) and vasopressin V2 receptor (V2R) are G-protein-coupled receptor members. In preliminary experiments, we found that the interaction between APJ and V2R in rat kidney collecting duct cells, but the mechanism of apelin regulated AVP remains poorly understood. Accordingly we made the scientific hypothesis as follows: the aquaretic effect of apelin involves a direct renal effect, through the interaction between APJ and V2R to regulate negatively of AVP and its receptor V2R in the intracellular signal pathway and aquaporin-2 expression. Using cellular and molecular biology experimental techniques, the project aims to clarify the molecular mechanisms of apelin on diuretic action. The crosstalk between apelin and AVP signaling pathways will be studied. Further work will be performed to investigate the interaction between APJ and V2R. Thus, apelin may constitute a complementary therapeutic target to V2 receptor antagonists, in order to provide theoretical basis for treatment and prevention of hyponatremia.

Apelin 和精氨酸加压素（AVP）共存于下丘脑大细胞性神经元。在体液渗透压影响下，apelin 控制 AVP 神经元活性和 AVP释放，参与体液平衡的维持。Apelin和AVP的作用受体APJ和V2R均属于G蛋白偶联受体。前期预实验发现大鼠集合管细胞中存在APJ和V2R的相互作用，但这种现象在apelin调节AVP作用中的机制尚未阐明。据此提出如下科学假说：apelin直接作用于肾脏，通过APJ和V2R之间的相互作用，负向调控AVP及受体V2R的细胞内信号和水通道蛋白的表达发挥利尿作用。本项目拟采用细胞和分子生物学等研究手段，深入探讨apelin调节AVP产生细胞内信号“crosstalk”的具体途径，结合受体APJ和V2R的相互作用，分析apelin调节AVP抗利尿作用维持体液平衡的机制。Apelin可以作为V2R拮抗剂补充性的治疗靶点，为低钠血症等相关疾病的防治提供新的选择和思路。

本课题以大鼠、大鼠肾脏集合管上皮细胞、人胚肾细胞（HEK293）为研究对象，采用细胞和分子生物学等研究手段，探讨apelin调节AVP抗利尿作用以维持体液平衡的具体机制。.研究结果：（1）从动物整体水平发现，在AVP合成和释放显著增加的哺乳期大鼠，静脉注射apelin-13能够显著降低大鼠血浆AVP水平、增加大鼠尿量、降低尿液渗透压；apelin-13直接作用于肾脏，通过降低大鼠肾脏外髓和内髓集合管上皮细胞中V2R和AQP-2蛋白的表达发挥利尿作用；在体实验中apelin-13可以显著降低dDAVP诱导的大鼠集合管上皮细胞中cAMP水平、增加钙离子的生成。（2）原代培养大鼠集合管上皮细胞，通过免疫共沉淀实验证实原生环境中apelin受体（APJ）和精氨酸加压素受体（V2R）之间存在相互作用，并且激动剂的诱导可以使受体之间的相互作用增强；离体实验中apelin-13可使dDAVP诱导的原代大鼠集合管上皮细胞中cAMP的产生显著降低、钙离子含量显著升高；通过添加Gαi/o蛋白阻断剂百日咳毒素（PTX）或钙离子螯合剂BAPTA孵育细胞证实，apelin-13可以通过激活细胞内的Gαi/o蛋白和Gαq蛋白通路，使dDAVP诱导的AQP-2蛋白表达显著下调。（3）采用质粒转染方法建立APJ和V2R过表达细胞模型，激光共聚焦技术检测证实APJ与V2R在细胞膜上存在共定位表达；利用荧光共振能量转移和生物发光共振能量转移技术从不同的角度证明APJ与V2R两受体在HEK293细胞中能够发生二聚化形成异源二聚体；APJ/V2R二聚体倾向于增强Gαi和Gαq亚型的G蛋白信号通路，减弱Gαs亚型的G蛋白信号通路；通过ERK1/2磷酸化水平的检测发现，相对于V2R单体细胞，dDAVP激活的APJ/V2R二聚体细胞中ERK1/2磷酸化水平显著降低，但是在apelin-13的作用下，APJ/V2R二聚体细胞中ERK1/2磷酸化水平却明显高于APJ单体细胞。.研究证实apelin直接作用于大鼠肾脏，通过负向调控AVP及其受体V2R的细胞内信号和AQP-2蛋白表达发挥利尿作用，受体APJ和V2R间的相互作用可以影响细胞内的信号通路。本研究为apelin/APJ系统参与机体体液平衡的调节机制提供实验依据，以期为低钠血症等疾病提供新的治疗思路和新药开发的作用靶点。