质粒介导qnrS和aac(6')-Ib-cr基因氟喹诺酮耐药分子机理及其播散机制研究

Fluoroquinolone is considered to be the primary antibiotic for the treatment of Enterobacteriaceae. Widespread use, however, has been accompanied by the emergence and rising incidence of fluoroquinolone-resistant strains in the world. The traditional understanding of resistance as a mutational phenomenon has not provided a fully satisfying explanation for the frequency with which this resistance has arisen. The plasmid-harbored genes such as qnrS, aac(6')-Ib-cr genes also contribute to the fluoroquinolone-resistance. But their resistance molecular mechanisms and effect on horizontal gene transfer of multi-resistance still was unclear. In this study, we will take S. flexneri 2a 301, E.coli J53 and fluoroquinolone-resistant S. flexneri clinical isolates (qnrS and aac(6')-Ib-cr positive) as samples. Their derivatives will be constructed by genes qnrS,aac(6')-Ib-cr knockout or insert, plasmids elimination or transfer. On the one hand, we will measure the minimum inhibitory concentrations (MICs) and the spontaneous mutation frequency before and after the treatments to explore the molecular mechanisms of plasmid-mediated quinolone resistance genes qnrS and aac(6')-Ib-cr. On the other hand, we will measure the transformant and conjugation frequency before and after the treatments to explore the effect of plasmid-mediated quinolone resistance genes qnrS and aac(6')-Ib-cr on horizontal gene transfer of multi-resistance. The study is anticipated to provide some scientific elements on controlling the spread of quinolone resistance genes and selecting the genomics-driven target for antibacterial drug discovery.

质粒介导qnr、aac(6')-Ib-cr 喹诺酮耐药的微观机理及其水平传播作用是近年来的研究热点。本研究以临床分离株（含qnrS 和aac(6')-Ib-cr）、福氏志贺菌301(不含qnrS和 aac(6')-Ib-cr)和大肠埃希菌J53 为样本菌株，以基因敲除或插入、质粒消除或转入等基因工程为手段，采用实验流行病学等设计方法，一方面通过测定和比较不同处理前后氟喹诺酮类抗生素最低抑菌浓度和氟喹诺耐药自发突变率等指标，探索质粒介导qnrS、aac(6')-Ib-cr 基因对耐药影响程度和微观机理；另一方面通过转化实验和接合实验测定和比较不同处理前后抗生素耐药基因（或质粒）的转化率和接合率，探索qnrS、aac(6')-Ib-cr 基因对耐药基因的水平传播作用。预期成果可为遏制耐药基因传播和研究抗菌药物作用靶点提供科学依据。

抗生素耐药及其机制是一个重大公共卫生问题。本研究以临床分离株（含或不含qnrS 和/或aac(6')-Ib-cr）、福氏志贺菌301(不含qnrS和 aac(6')-Ib-cr)和大肠埃希菌J53 为样本菌株，通过测序、基因插入、质粒转入或消除等基因工程手段，采用实验流行病学等设计方法，对氟喹诺酮耐药机制进行研究，项目现按计划时间结题，申报书提出的预期目标较好地完成。. 本研究获得主要结果：一是通过耐药性监测，指出杭州地区福氏志贺菌对氟喹诺酮类抗生素耐药近几年快速上升（从1998-2007年平均8.6%增加到2016年的100%），抗生素耐药形势不容乐观。二是通过对氟喹诺酮耐药机制进行研究，发现59株氟喹诺酮耐药菌株均含有gyrA83 和parC80点突变，其中52株gyrA87点突变，7株携带含qnrS基因质粒，表明在喹喏酮类药物耐药性基因（gyrA83和parC80）点突变的基础上，gyrA87点突变或获得质粒介导qnrS基因会导致志贺菌氟喹诺酮耐药。三是通过在不同菌株中转入或消除含qnrS 和/或aac(6')-Ib-cr基因的质粒，比较氟喹诺酮类抗生素最低抑菌浓度的变化，进一步证实质粒介导qnrS、aac(6’)-Ib-cr基因单独存在时，不能直接导致志贺菌和大肠杆菌氟喹诺酮耐药，而是与喹喏酮类药物耐药性决定区基因点突变间和质粒介导耐药基因间存在协同作用，预期成果可为研究抗菌药物作用靶点提供科学依据。四是通过全质粒测序，首次获得在志贺菌中含qnrS基因和aac(6')-Ib-cr基因质粒的完全序列，分析质粒的携带耐药基因及遗传进化特征，预判这些质粒在水平传递中通过重组等方式进化。五是通过比较含及不含qnrS 和/或aac(6')-Ib-cr氟喹诺耐药自发突变率的变化、接合实验、及含qnrS 和/或aac(6')-Ib-cr的质粒稳定性等，探索含qnrS、aac(6')-Ib-cr 基因的水平传播情况，结果表明qnrS、aac(6’)-Ib-cr基因的质粒可在细菌间通过接合方式传递，导致菌株对多种抗生素耐药，且含qnrS、aac(6’)-Ib-cr基因的质粒在不同菌中有不同的稳定性，含qnrS、aac(6’)-Ib-cr基因的志贺菌的氟喹诺耐药自发突变率有所增加。预期成果可为遏制耐药基因传播提供科学依据。