利用冷冻电子显微学研究人类RNA干扰通路中RNA诱导沉默复合体装载复合物的结构与分子机理

The RNA interference and its related RNA-induced silencing pathways have been revealed to be a major gene regulation mechanism in eukaryotic cells. Since its discovery more than a decade ago, the mechanism and application of this pathway have been the focus of biomedical research. During the RNA interference pathways, matured small interfering RNAs (siRNAs) and microRNAs (miRNAs), which are loaded into the RNA-induced silencing complex (RISC), recognize their target messenger RNAs via sequence matching and induce the specific gene silencing by repressing the translation of messenger RNAs. The small RNAs are processed and loaded into RISC in a complex termed RISC-loading complex (RLC). The lack of structural information of RLC has limited our understanding of the RNA interference pathway and the technical application based on this pathway. The purpose of this proposal is to reveal the structure and conformational changes of human RLC and its complexes with RNA substrates using cryo-electron microscopy and to elucidate the dynamic interactions among the RLC component proteins and the regulation of the interactions. Our ultimate goal is to decipher the detailed molecular process of the small RNA processing inside RLC so to understand the biogenesis and maturation of small RNA in the RNA interference pathways. Our research will provide important insights to the understanding of RNA interference pathways and guide design more efficient small RNA precursors for the application of RNA interference technology.

RNA干扰及相关的RNA介导的基因沉默通路是真核生物细胞中的重要基因调控机制之一。自从该通路在十几年前被发现以来，对它的分子机制和应用前景的研究迅速成为生物医学研究的重要前沿和热点。在该基因调控通路中，装载在RNA沉默诱导复合体中的小RNA分子（包括siRNA和miRNA）通过与标靶信使RNA的序列匹配来特异性地抑制信使RNA的翻译，从而导致基因表达沉默。小RNA的最终加工及装配是在RNA沉默诱导复合体装载复合物（RLC）中完成的。目前对该复合体的结构信息非常匮乏，限制了对RNA干扰途径的理解和技术应用。本项目拟利用冷冻电子显微学对人类RLC及其与RNA底物形成的复合体的结构和构象变化进行解析，并在此基础上对复合体中各成分之间的动态相互作用及其调节进行研究，揭示RLC在加工和装载小RNA前体过程中的具体分子过程，从而深入理解小RNA分子被加工成熟的分子机制。

RNA干扰及相关的RNA介导的基因沉默通路是真核生物细胞中的重要基因调控机制之一。在该基因调控通路中，装载在RNA沉默诱导复合体中的小RNA分子（包括siRNA和miRNA）通过与标靶信使RNA的序列匹配来特异性地抑制信使RNA的翻译，从而导致基因表达沉默。小RNA的最终加工及装配是在RNA沉默诱导复合体装载复合物（RLC）中完成的。本项目主要利用冷冻电子显微学及单颗粒图像处理技术对人RISC加载复合物(RLC)及其主要组成蛋白质Dicer与多种RNA底物以及第二类内含子及其逆转录酶复合体、酵母细胞质中内源性外切体复合物以及催化DNA链交换的人源重组酶RAD51纤维的结构进行解析，并结合其它生物物理与生物化学方法，最终揭示RLC等工作的分子机制，从而深入了解小RNA被加工成熟的分子机制。.经过研究，我们首次获得了人源Dicer蛋白及其与多种小RNA前体复合体的冷冻电子显微镜结构，发现了siRNA前体及miRNA前体的不同结构导致它们诱导人源Dicer产生不同的构象变化，从而导致前者难以接近而后者很容易到达Dicer的酶活位点，该发现首次为人源Dicer切割不同RNA底物活性的差异提出了分子机制上的解释；发现了pre-miRNA通过末端环状结构（terminal loop）Dicer蛋白的helicase结构域，而Helicase结构域构象的变化对Dicer蛋白的酶切活性具有调控作用，对于理解人Dicer蛋白如何加工pre-miRNA提供了新思路，并引出了在基因沉默调控中miRNA末端环状结构作用的新问题；获得了乳酸菌内源提取的具有天然活性的内含子LtrB及其编码的蛋白质LtrA形成的分子量为380kDa的核糖核蛋白复合物的3.8埃分辨率的三维结构，酵母Exo-Ski7的RNA-free和RNA-bound两种构象的4.2埃和5.8埃的三维结构，链交换之前的RAD51-单链DNA与交换之后产物RAD51-双链DNA的近原子分辨率结构，最终建立了一套成熟的研究相对较小的动态的蛋白质复合物的技术方法。