Bacillus amyloliquefaciens ZDS-1降解玉米赤霉烯酮的途径及其分子机理研究

Zearalenone (ZEN) is one of the estrogenic mycotoxins produced by Fusarium sp., which is very common in corns. ZEN is highly toxic and does great harm to the health of animal and humans. Degradation of ZEN by microorganism is the practical way to control ZEN contamination. However, the degradation mechanism of ZEN has not been completely elucidated, the complete degradation pathway and related genes still need to be studied. Bacillus amyloliquefaciens ZDS-1 was isolated in our lab; the strain can degrade ZEN completely. We have investigated the degradation characteristics of ZEN by strain ZDS-1 and its field application effects. We have constructed mutant library of Bacillus amyloliquefaciens ZDS-1 by transposon mutation. The target of this program is to elucidate the complete degrading pathway of ZEN by the method of substrates utilization and metabolites identification; to get the genomic sequence with the aid of new DNA sequencing platform, to clone the ZEN degrading genes involved in the pathway by the method of genome analysis combined with general molecular manipulation, and to express the ZEN detoxification genes in yeast and investigate the enzyme characteristics.. The result of this study will elucidate the degrading pathway and molecular mechanism of ZEN by ZDS-1, lay the foundation for the development of ZEN detoxification enzymes and genetically modified crops, and provide the theoretical and technical foundation for controlling ZEN contamination.

玉米赤霉烯酮（ZEN）是一种由镰刀菌产生的类雌激素性质的毒素，具有极强的毒性，严重危害人畜健康。微生物降解毒素具有很好的应用前景。目前关于微生物降解ZEN的机理研究还不充分，完整的降解途径及参与基因尚不清楚。Bacillus amyloliquefaciens ZDS-1是本课题组分离的能降解ZEN的菌株，已经明确了该菌株的降解特性、田间控毒效果，并构建了ZDS-1的突变体文库。本研究以该菌株为研究对象，通过底物利用和产物鉴定技术剖析ZEN降解途径；借助于DNA高通量测序平台获得全基因组序列；运用基因组学和分子生物学相结合的方法鉴定ZEN降解相关基因，从基因水平阐明细菌降解ZEN的途径；研究脱毒酶基因的酵母表达和酶学特性。本研究结果将能解析细菌降解ZEN的途径及分子机理，为ZEN解毒酶制剂和转基因作物的开发奠定基础，为ZEN污染的生物控制提供理论和技术支撑。

玉米赤霉烯酮（ZEN）是一种由镰刀菌产生的类雌激素性质的毒素。它具有极强的毒性，严重危害人畜健康。微生物降解是控制ZEN污染的主要方法。目前关于微生物降解ZEN的机理研究还不充分，完整的降解途径及参与的基因还不清楚。为此本项目以前期分离到的ZEN降解菌ZDS-1为研究对象，采用Illumina Miseq测序的方法对ZDS-1进行了全基因组测序，并对该基因组进行了解析，分析了可能与ZEN酯酶活性相关的基因；为了制备大量高纯度的ZEN毒素用于后续的研究，筛选并改造了ZEN产毒镰刀菌Fusarium graminearum FAZ-003，改进优化了ZEN制备和纯化工艺，经优化后，每kg发酵物中可提取出1.3g ZEN纯品，从而实现了ZEN的大量制备；研究了降解菌ZDS-1对ZEN的降解特性，明确了ZDS-1对ZEN的最佳降解条件和动力学特征，分离纯化了ZDS-1降解ZEN的产物，采用高分辨质谱鉴定了降解产物的分子量和结构，在此基础上推导了ZDS-1对ZEN的代谢途径；考虑到ZDS-1转座突变子筛选过程中，需要对每一个插入子进行降解功能检测，费时费钱，为此构建了以酯酶活性为基础的玉米赤霉烯酮降解活性筛选体系；利用携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA，采用电转化方法，成功转化了Bacillus amyloliquefaciens ZDS-1，并在高温条件下，构建了ZDS-1的转座子文库，利用玉米赤霉烯酮降解活性筛选体系初筛突变子文库对ZEN的降解功能，初步获得22个转座突变子，然后使用HPLC-MS复测，最终筛选出5株转座突变子，采用反向PCR的方法对转座插入子中转座子侧翼序列进行了克隆，分析可能与ZEN降解功能相关的基因；对具有ZEN降解功能的ZDS-1上清液进行了蛋白测序，根据测定结果分析与ZEN降解相关的蛋白，结合转座突变子的侧翼序列结果，得到和ZEN水解酶基因相关的2个基因0521和0647，把这两个基因连接到表达载体pET29 上，转化至大肠杆菌中进行了外源表达，结果显示基因0647是ZDS-1的水解酶基因；分离纯化了ZEN水解酶基因，并研究了该酶的酶学特性。本研究结果解析了细菌ZDS-1降解ZEN途径及分子机理，为ZEN解毒酶制剂和抗毒素转基因作物的开发奠定基础，为ZEN污染的生物控制提供理论和技术支撑。