野生烟草（Nicotiana alata）中抗番茄斑萎病毒基因的克隆和鉴定

Tomato spotted wilt virus (TSWV), is the type member of the genus Tospovirus, which causes severe economic losses in many crops worldwide. Now TSWV is a serious threat to tobacco production in the Yunnan province, China. Use of TSWV resistance cultivar offers an effective control strategy and significant potential in reducing fungicide. Recent studies have found that Nicotiana alata has broad-spectrum resistance to TSWV and other Tospoviruses. In addition, N. alata resistance to TSWV infection is controlled by a single dominant gene which corresponds to the NSm avirulence gene in the TSWV. This project will attempt to clone the TSWV resistance gene from N. alata by using the resistance gene analogous sequences, RNA-seq transcriptome sequencing and/or candidate gene transient silencing strategy. This project will also identify the resistance gene by using transgenic plants to overexpress and silence the candidate genes. This research will contribute to an understanding of the mechanism of TSWV disease resistance and the development of improved tobacco varieties with disease resistance traits.

番茄斑萎病毒属（Tospovirus）病毒是寄主范围最广、发生最为严重的一类植物病毒，其代表种番茄斑萎病毒（Tomato Spotted Wilt Virus, TSWV）已对云南烟区的烟叶生产构成了巨大的威胁，并有扩大和加重的趋势。发掘抗病基因培育抗病烟草品种是防治该病害最有效的防治手段。最近研究发现，野生烟草Nicotiana alata 对TSWV及Tospovirus属其他病毒具有很好的抗性，通过遗传学和分子标记筛选发现该抗性由显性单基因控制, 并已初步确定其对应的无毒基因（avr）。本项目将通过同源基因克隆、RNA-seq转录组测序以及瞬时沉默候选抗病基因技术从N. alata中分离抗TSWV的关键候选基因，并通过转基因过表达和RNA干扰进行候选抗性基因功能鉴定。项目结果对于明确新抗性基因抗TSWV的机理具有重要科学意义，还为培育抗TSWV的新品种提供基因资源具有重要实践意义。

云南烟区斑萎病近年呈急剧爆发趋势，但缺乏系统性研究。.1、本项目2014-2018年对云南9个州（市）烟区进行田间调查，采集566个疑似斑萎病症状样品（包括烟草、周边杂草和作物），利用血清学检测和分子生物学鉴定阐明了云南烟草斑萎病的危害和分布特点，确定病原以TSWV为主、TZSV为辅。确定云南烟区马铃薯、辣椒、番茄、鬼针草等为TSWV和TZSV主要中间寄主。.2、通过转录组测序国际上首次揭示了TZSV侵染后烟草的响应机制，为解析病害症状形成机制、病毒与植物之间互作机理提供了重要线索。.3、本研究采用优化的人工接种病毒抗性鉴定方法，确定现有主栽烤烟品种高感TSWV和TZSV。.4、引进国际上唯一的栽培烟草抗源Polalta（其显性单基因以RTSW表示）。确定RTSW高抗云南本地TSWV，新确定其高抗TZSV和INSV，具有很高的育种价值。.5、通过同源克隆和转录组差异表达分析，获得Polalta中与抗性连锁的NBS-LRR类的候选基因7个，采用瞬时表达、过表达方法证明了这7个同源基因不抗TSWV。将上述同源基因序列开发为与抗性连锁的分子标记，并应用于育种群体抗性鉴定。.6、国际上首次确定烟草RTSW对应的无毒基因为NSm，RTSW与番茄Sw-5b识别的NSm的活性区域不同，明确烟草中RTSW基因不是番茄Sw-5b的直系同源基因。为RTSW基因的克隆指明了方向。建立了农杆菌浸润接种无毒基因瞬时表达载体的快速、精准抗性鉴定方法，并应用于候选基因功能、育种材料抗性鉴定。