吡虫啉抗性棉蚜UGT共轭代谢的表达调控

Illumination of resistance mechanism is an important basis for cotton aphid resistance management. As an important metabolic enzyme, the role of UGTs in the insecticide resistance is little known. Preliminary results showed that the mRNA and protein levels of UGT344B4 and UGT344C7 were significantly high in the cotton aphid with imidacloprid resistance. The knockdown of UGT344B4 and UGT344C7 by RNAi significantly decreased the tolerance ability of the resistant aphids to imidacloprid. Based on these results, we speculate that UGT344B4 and UGT344C7 play an important role in imidacloprid resistance. This project aims to identify the promoter cis elements of UGT344B4 and UGT344C7, and identified transcription factors and miRNAs that targeting UGT344B4 and UGT344C7. This study will deepen the understanding of the regulatory pathway of UGT expression and the mechanism of insect resistance formation mediated by UGT.

深入解析抗药性机制是抗性棉蚜治理的重要基础。UGTs作为重要的II型代谢酶，其在抗药性中的作用还知之甚少。前期研究发现UGT344B4和UGT344C7的mRNA及相关蛋白在吡虫啉抗性棉蚜中过量表达，RNAi敲除UGT344B4和UGT344C7显著减弱了抗性棉蚜对吡虫啉的耐受性。基于上述结果，我们推测棉蚜UGT344B4和UGT344C7在吡虫啉抗性形成中起到了重要作用。本项目拟分离、鉴定出UGT344B4和UGT344C7启动子顺式元件及与之结合的转录因子，找出对靶基因具沉默作用的miRNA，从而明确吡虫啉抗性棉蚜UGT344B4和UGT344C7超量表达的调控机制。该研究将加深对UGT表达调控途径及UGT介导的害虫抗药性形成机制的认识。还可为抗性棉蚜防治提供新的思路，为新农药的创制提供新的分子靶标。

棉蚜（Aphis gossypii Glover）是一种世界性的农业害虫。多年来，棉蚜的防治多依赖于化学药剂的使用，因此棉蚜对多种杀虫剂产生了不同水平的抗药性。新烟碱类杀虫剂，尤其是吡虫啉，在中国Bt棉区被广泛用于棉花害虫的防治，导致棉蚜对新烟碱类杀虫剂产生了高水平的抗药性。在杀虫剂的选择作用下，昆虫发展出不同抗药性机制，包括代谢抗性、靶标抗性、渗透抗性、行为抗性等。本项目通过对棉蚜对新烟碱类杀虫剂的抗药性机制的研究，探究了棉蚜UGTs在抗性水平棉蚜中过量表达调控机制，明确了中国棉区棉蚜抗药性的主要机制。主要研究结果如下：对2014年中国Bt棉区棉蚜的抗性监测，发现棉蚜对吡虫啉产生了不同水平的抗药性，尤其是山西运城采集到的棉蚜对吡虫啉产生了极高的抗药性。用1000 μg mL−1在室内筛选，获得吡虫啉抗性品系。对其它药剂的生测结果表明，吡虫啉抗性品系对其它药剂，包括新烟碱类杀虫剂、氨基甲酸酯类杀虫剂、有机磷类杀虫剂、拟除虫菊酯类杀虫剂，都产生了不同水平的抗药性。通过对吡虫啉敏感品系和抗性品系转录组和蛋白质组学分析发现，在转录组水平差异表达的512个基因中包括12个UDP-糖基转移酶基因，在蛋白水平差异表达的510个蛋白中包括3个UDP-糖基转移酶蛋白。荧光定量实验结果表明在吡虫啉抗性品系中UGT343A4、UGT344A15、UGT344A16、UGT344B4、UGT344C7、UGT344C9、UGT344N4、UGT24541和UGT7630 9个基因在转录水平上过量表达。Western blot实验结果表明在吡虫啉抗性品系中UGT344A16、UGT344B4、UGT344C7和UGT344N4在蛋白水平过量表达。更进一步，通过RNAi干扰掉UGT344B4和UGT344C7显著增加了吡虫啉抗性品系棉蚜对吡虫啉的敏感度。以上结果表明UGT的过量表达可能是棉蚜对吡虫啉产生的抗药性重要机制。基于棉蚜miRNA数据库，通过生物信息学软件预测及荧光定量PCR验证候选miRNA在吡虫啉抗性和敏感两品系的差异表达分析，发现抗性品系中有6个miRNA的表达量均有所降低，说明均有可能对UGT334B4、UGT334C7起转录后调控作用。双荧光素酶报告检测结果表明，Ago-novel-10a对UGT334B4起转录后调控作用。