厚果崖豆藤中新型微管抑制剂Pachycarpaone的微管抑制机制研究

Microtubule is one of the important targets of anti tumor drugs, but because of the drug resistance and toxicity limit its clinical application. Therefore, the discovery of novel microtubule inhibitors is meaningful. Our group isolated a novel benzil compound from Millettia pachycarpa Benth, Pachycarpone (PA). In in vitro study, PA could significantly inhibit the proliferation of HepG2 cells with efficient concentration of 200 nM, directly interact with microtubule, inhibit tubulin polymerization, and the microtubule binding assay and the computer simulation showed that PA did not interact with the normal binding site, which was paclitaxel, vincristine and colchicine binding site. In order to deeply research the interaction mechanism of PA and microtubule, based on the previous research, the following research will be carried out: 1) illustrates that the influence of PA on the microtubule by immune-fluorescence and in vitro and in vivo microtubule polymerization experiment; 2) reveals that PA does not interact with the conventional microtubule binding sites by microtubule competition binding experiments and computer simulation experiments; 3) explores the specific binding site by ESI-Q-TOF mass spectrometry analysis, protein analysis, computer molecular docking and site-directed mutagenesis technology; 4) research antitumor efficacy of PA.

微管是抗肿瘤药物研究的重要靶点之一，但由于耐药性和毒性限制其临床应用,因此，发现新型微管抑制剂具有重要意义。本课题组从厚果崖豆藤中分离得到一个具有全新结构的苯偶酰类化合物， Pachycarpone（PA），体外实验表明PA影响细胞微管的聚合，其有效浓度为200 nM。本项目前期研究阐明PA是直接作用于微管蛋白而抑制其聚合，并且初步的微管竞争实验和计算机模拟都显示PA并不作用微管蛋白的常规位点（紫杉醇/秋水仙碱/长春新碱位点），这提示PA可能作用于微管蛋白一个新的位点。因此，在本项目中申请人对PA抑制微管聚合的机制进行深入研究：通过微管免疫荧光和体内微管聚合实验说明PA对微管的影响；通过同位素标记的微管竞争结合实验证实PA是否作用于微管上的常规位点；通过ESI-Q-TOF质谱解析和蛋白鉴定及定点突变技术对PA作用微管蛋白位点进行探讨；建立皮下肿瘤模型以及耐药模型对PA抗肿瘤药效学进行研究。

与细胞微管蛋白作用的天然产物无疑是天然抗肿瘤药物中非常重要的一类。自从1992年美国FDA批准紫杉醇作为治疗卵巢癌和乳腺癌的一线用药上市以来，以微管为靶点的微管抑制剂就是临床上使用十分有效且成功的抗肿瘤药物。虽然紫杉醇作为治疗卵巢癌和乳腺癌的一线用药上市以来，已经在临床取得巨大成功，但是紫杉醇和其第二代药物多西紫杉醇内源性和获得性的多药耐药性以及剂量限制性的毒性等缺点促使继续发现新型天然微管蛋白抑制剂成为必然。本项目“厚果崖豆藤中新型微管抑制剂Pachycarpaone的微管抑制机制研究”主要针对该化合物抗微管作用的位点和机制进行研究，为发现抗肿瘤作用新靶点、发展新型抗肿瘤药物及临床应用奠定试验基础。其主要研究内容为：1. 通过免疫荧光技术和体内微管聚合实验说明Pachycarpaone对微管的影响；2 确定Pachycarpaone和微管的作用位点；3 通过结构生物学的手段确定作用位点；4完成Pachycarpaone的体内药效学评价。综上，课题主要完成了以下内容：1. 项目对Pachycarpaone作用于肿瘤细胞微管蛋白产生的影响以及其作用靶点进行了研究，研究结果表明Pachycarpaone是通过直接抑制微管蛋白聚合而对肿瘤细胞产生影响的；通过biotin标记的Pachycarpaone和细胞裂解液共孵育后的pulldown实验表明Pachycarpaone能和β-tubulin特异性的结合，且结合是时间依赖性的；微管蛋白体外聚合曲线来表明Pachycarpone可以直接作用于微管蛋白而影响微管的聚合；竞争结合试验表明1uM的秋水仙碱能较弱的影响pachy和β-tubulin的结合；而10uM的秋水仙碱能完全抑制其结合；表明pachy作用于β-tubulin的秋水仙碱位点；结合方式考察pachy和β-tubulin的结合方式可能为共价结合；晶体结构研究表明Pachy能作用于秋水仙碱位点，且还能通过氢键和α-tubulin的Thr179相互作用；药效学实验表明pachy能在体内抑制肿瘤生长。本项目共发表文章：发表基金标注文章共计5篇，还在投稿文章2篇。