手性DNA碱基的纳米孔单分子研究

In the human genome, some DNA bases possess a stereocenter and exist as stereoisomers. It is crucial to study these chiral bases, as the stereochemistry may have influences on the stability of the DNA structures, the interactions with DNA enzymes, and the mutagenicity. Meanwhile, the high similarity between stereoisomers makes it a challenge to unveil their individual properties. Spiroiminodihydantoin (Sp) and 5-Guanidinohydantoin (Gh), which are the secondary oxidative products of guanine, are two typical chiral bases and have S and R diastereomers. The emergence of Sp and Gh in the genome will cause DNA mutations, cell apoptosis, and even cancers. In this proposal, we develop a single-molecule sensing platform for the study of chiral Sp and Gh, utilizing the Aerolysin nanopore. On this basis, the interaction of the chiral Sp and Gh with DNA enzymes and the isomerization between the two diastereomers can be further explored. The developed methodology opens new possibilities for the examination of the biological functions and chemical properties of chiral bases.

人体基因组中，少部分特殊碱基由于结构中存在立体中心而呈现手性。碱基的立体构型对DNA双链结构的稳定性、与DNA酶的相互作用、以及致突变性都有潜在影响，因此对碱基手性的研究具有非常重要的意义；与此同时，手性碱基不同异构体之间结构的相似性大大提高了研究难度。鸟嘌呤在活性氧（ROS）作用下的深度氧化产物Spiroiminodihydantoin（Sp）与5-Guanidinohydantoin（Gh）是两种典型的手性碱基，具有S与R两种异构体，人体中过量存在时可引起基因突变、细胞凋亡、甚至癌变。以Sp与Gh为研究对象，本项目书建立了基于嗜水气单胞菌毒素（Aerolysin）纳米孔的单分子手性研究平台。以此为基础，可进一步研究Sp或Gh手性对其与DNA修复酶hNEIL1相互作用的影响及Gh不同立体构型间的异构化过程。本项目书开发的方法为手性碱基生物学功能与化学性质的研究提供了新的平台。

本项目建立了通用纳米孔手性分析平台与纳米孔测序平台，并分别应用于L/D型DNA异构体区分和修饰碱基测序，同时搭建了纳米孔-DNA模拟体系，对纳米孔中测序电流变化的微观机制进行了研究。具体如下：.1. Aerolysin由于其独特的孔道结构与物化性质，具有高的空间分辨率与时间分辨率，在核酸、多肽和蛋白等多个领域受到广泛关注。本工作搭建了基于Aerolysin的纳米孔单分子分析平台，并成功用于L型与D型DNA的手性区分。L-dA5与D-dA5在Aerolysin中均造成单一的穿孔信号峰。相较于D-dA5，L-dA5表现出更小的阻滞电流，差值约1.2 pA，以及慢1倍的穿孔速度。有趣的是，L-dA5在穿孔频率上也仅为D-dA5的一半左右。原因目前仍不清楚，但应该来源于L型与D型DNA同由L型氨基酸组成的Aerolysin纳米孔之前不同的空间匹配与相互作用。进一步得，我们验证了ExoI核酸酶对两种手性DNA的差异化水解能力。此工作将能有效推动合成生物学的发展。.2. 纳米孔测序是新一代测序技术，可对原始DNA分子直接测序，天然适合于修饰碱基检测。本工作基于MspA纳米孔与Hel308解旋酶搭建了具备单碱基分辨率及毫秒级时间分辨率的纳米孔测序平台。基于此平台，通过特异性酶介导的反应，设计了一种普适性的DNA修饰碱基测定方法，目前数据正在分析整理中。本方法的成功开发将为DNA碱基修饰的定点定量检测提供新的工具。.3. 不同核苷酸在穿过纳米孔缩窄位域（constriction）时会产生特异性离子电流实现其区分。然而，测序时纳米孔中电流变化的机理原因仍不清晰。本工作通过全原子分子动力学模拟对单链DNA穿过MspA纳米孔时电流变化的微观机制进行了探究。结果显示，除了核苷酸碱基的物理刚性与尺寸，其空间取向也会对电流造成不可忽视的影响。同时我们发现，当单链DNA以碱基-缩窄位域-碱基的形式（发卡状组装）啮合通过纳米孔缩窄位域时，缩窄位域下方的紧邻位置具备区分单个核苷酸的能力。此工作为低成本、高通量纳米孔DNA测序技术的开发提供了一定的指导意义。