血管化卵巢去细胞生物支架诱导FGSCs分化研究

Ovary is one of the most important organs in the female reproductive system.Searching positive treatment target for premature ovarian failure(POF) is one of the hot spot in both gynecology and reproductive medicine field, including ovariectomy along with transplantation.The rapid development of tissue engineering,especially the establishment of vascularized tissue engineering ovarian tissue.provides a new method for POF treatment..Based on the former published literature and preliminary experiment of our team, we established an ovarian cell biological scaffold based graft, and transplanted to the edge of uterus in SD rats, then FGSCs and GCs was injected into the biological scaffold. The expression of modulin on follicular developmentwas detected by RT-PCR and immunofluorescence, the follicular developmentwas was observed by HE, the interaction between FGSCs with biological scaffold and its phenotype was investigated by laser confocal microscope scanning, in aiming to explor the possible mechanism of regulating the FGSCs differentiation. Our study will answer the question weather the technology platform for FGSCs stent can be used in the treatment ofovarian disease, and provide evidence for future exploration of ovarian cell differentiation mechanism and organ reconstruction.

卵巢是女性重要的生殖和内分泌器官。卵巢手术切除与功能的丧失给患者及家庭带来了极大的痛苦。如何修复卵巢损伤和重建卵巢功能，是当前妇科及生殖医学领域面临的巨大挑战。组织工程学的迅速发展特别是构建能够血管化可移植的组织工程卵巢组织为治疗卵巢功能丧失提供了新思路。基于相关文献和前期实验，项目组通过将构建的卵巢去细胞生物支架部分移植到正常SD 大鼠子宫边缘，将FGSCs和GCs 通过局部注射到血管化的生物支架内，通过RT-PCR 、免疫荧光检测调控卵泡发育蛋白的变化、HE观察卵泡发育情况、光扫描共聚焦显微镜下观察检测FGSCs与生物支架相互作用及表型。观察FGSCs 在生物支架中的多能特性，研究调控FGSCs分化的可能机制。从而为血管化卵巢去细胞生物支架能否作为全新技术平台应用于卵巢疾病、卵巢内细胞分化机制、体内器官重构等研究领域奠定实验基础，并为卵巢去细胞生物支架应用于卵巢组织工程提供新思

卵巢早衰患者时常面临着过早绝经的痛苦，目前治疗手段包括激素替代疗法和卵巢冷冻技术，这些技术存在着风险。去细胞技术被越来越广泛地应用于再生医学领域，通过移除组织中的细胞组分，保留细胞外基质，为器官再生提供生物支架。为研发新的异种卵巢去细胞方案，并评估其在再生医学中的应用价值，本项目通过振荡法制备猪和大鼠去细胞卵巢生物支架，并利用HE、免疫荧光染色和电镜鉴定去细胞卵巢生物支架结构与形态，对大鼠去细胞卵巢生物支架进行残留DNA含量测定，CCK-8和细胞迁移实验检测大鼠去细胞卵巢生物支架毒性及细胞活性，皮下包埋实验通过检测CD68+、CD86+、CD3+免疫反应细胞来证明体内移植后免疫反应。结果表明制备的猪和大鼠去细胞卵巢生物支架结构完整，DNA基本被去除，并保留了大部分FGF、CTGF、VEGF 和PDGF6等细胞因子，CCK-8实验结果显示卵巢颗粒细胞在不同浓度的支架浸提液中培养1、3、5天后，其OD值与使用标准培养基的对照组没有显著性差异（P＞0.05）。在细胞迁徙实验中，GCs与去细胞支架的共培养体系中，其迁徙的趋势相较无支架培养组更加明显，提示去细胞卵巢支架能够促进卵巢颗粒细胞的增殖与迁徙。皮下包埋实验显示大鼠去细胞卵巢生物支架具有低免疫原性。获取窦前卵泡和GCs，通过RT-PCR和Western blot，发现OCT4的表达，证实了GCs中的有多能性基因表达，在成功进行体外培养的基础上建立GCs与去细胞卵巢生物支架混合培养体系。大鼠GCs和猪卵巢去细胞支架共培养结果显示去细胞卵巢支架可以支持大鼠卵巢颗粒细胞的粘附，迁移以及促进雌二醇分泌功能。构建卵巢去细胞生物支架体内移植血管化动物模型，术后14天，移植物内有大量新生血管形成，移植术后28天后，移植的支架区域范围缩小，但依然能够看到大量新生血管与细胞。在体内移植大鼠去细胞卵巢生物支架术后14天时局部注射移植GCs，14天后FSHR免疫荧光鉴定显示GCs散在分布于血管化去细胞卵巢生物支架内；在血管化去细胞卵巢生物支架移植到体内14天后，通过局部注射方式移植窦前卵泡，结果显示移植后第14天时，仍有大量FSHR阳性细胞存在，而凋亡相关蛋白 Bax 的表达量明显上升，Bcl-2 的表达量明显降低，使 Bcl-2/Bax 比率下降，表明颗粒细胞凋亡。