一个新的水稻外颖扭曲突变体LD基因的精细定位与图位克隆

The yield and quality of rice production are directly impacted by the developlment of flower organs. Understanding flower development has been greatly aided by studies of floral development mutants. In this study, a rice lemma distortion mutant with indica cultivar 'PW33' background, was obtained in M0 population treated with 60Co γ-ray. Based on preliminary mapping of the LD gene, this proposal seeks fine mapping and cloning of the the LD gene using a recombination introgression F2 population between an ld mutant (an indica rice) and Taigen 9 (a japonica rice). Using the comments Gene Bank sequence information, the related genes with rice floral organ development will be analyzed. With RT-PCR analysis and sequencing the wild type and mutation type, the candidate gene will be determined. The functional complementation for the condidate gene was conducted by transgene technology, and the candidate genes will be clear. The temporal and spatial distribution patterns of the LD gene will be analyzed by in situ RNA hybridization, in the floral meristem and floral organ. Success of the project will provid basis of the basic genetic mechanism of lemma formation in rice.

水稻产量和品质受花器官发育的直接影响，水稻花器官发育相关突变体是研究颖花发育的重要材料。本研究以PW33经过60Co辐照后代获得一个能稳定遗传的外颖扭曲突变体MU103为材料，基于申请者初步定位水稻外颖扭曲突变体LD（Lemma distortion）基因基础上，利用ld突变体（籼稻）和台粳9号（粳稻）构建的F2 分离群体，对LD基因进行精细定位和图位克隆，利用GeneBank 中序列注释信息，分析筛选出可能与水稻花器官发育有关的基因，并用RT-PCR和测序分析野生型及突变型，确定候选基因，通过转基因技术对候选基因进行遗传互补验证，明确所得侯选基因的功能，再通过RNA原位杂交分析LD基因在花分生组织和花器官中的时空表达模式，初步了解水稻外颖发育遗传机制。本研究结果将为阐明水稻颖壳发育的遗传机制及分子进化的相关研究提供理论依据。

本项目的预期目标是对水稻外颖扭曲突变体ld 基因进行定位、克隆，获得控制水稻外颖基因LD，并对基因功能进行验证。本项目以ld /台粳9号构建的F2群体中的1640个隐性个体为定位群体，用SSR标记和Indel标记对控制水稻外颖发育的基因ld，进行了初步定位和精细定位，并构建了目标基因区域跨跌克隆群，最终将ld定位在15.6 kb范围内，完成了对ld基因的初步定位和精细定位。对这15.6 kb范围内的基因数目和结构进行了预测和分析，共发现LOC_Os07g32510 和LOC_Os07g32520两个基因。对该区域进行了测序和比对，结果表明：在这15.6kb范围内，仅在LOC_Os07g32510中存在突变，即在第1个外显子有一个碱基的突变（T-C），最终导致其编码的氨基酸由半胱氨酸变为精氨酸, LOC_Os07g32510是编码一个锌指蛋白转录因子。生物信息学分析表明，该突变发生在其保守的区域，并改变其蛋白结合位点，可能影响其生物学功能。故将该基因作为候选基因。将目标基因克隆到pMD18-T载体上，用农杆菌转化突变体成熟胚，转基因阳性植株穗部退化表型得到恢复，该结果进一步证实该基因功能。 RTPCR分析表明LD基因在水稻根、茎和叶中表达较低，基本不表达，而在水稻穗子中表达水平较高。该研究克隆的LD基因未见报道，是一个控制水稻外颖发育的新基因。该研究克隆的基因对研究水稻颖花发育的分子机理具有重要的意义。本项目达到了预期研究目标。