循环肝癌干细胞异质性研究及其在肝癌转移复发中的作用

We screened circulating liver cancer stem cells（CLCSC）from most of the patients with Hepatocellular Carcinoma (HCC) and found its close relationship with the prognosis of those patients in our previous study, while the heterogeneity of CLCSC and its clinical significance were still ambiguity. In this study, we plan to 1) Develop and modify a new CLCSC screen system based on immunomagnetic beads microfluidic chip.2）Investigate CLCSC with different stem-cell markers, and from different time zone of treatments, and then analyses the relationship with the clinical characteristics. 3）Explore gene expression profiling of CLCSC and develop a new recurrence gene signature based on Single-Cell genomics system. 4) Reveal the effects of NanoHHI on CLCSC and its mechanism. In summary, a noval stratagem to predict HCC recurrence and metastasis and a new intervention method are expectable from this study.

我们前期研究发现，肝癌患者外周血中存在具有干细胞特性的循环肝癌干细胞（Circulating Liver Cancer Stem Cells，CLCSC）并与肝癌预后密切相关。CLCSC具有明显的异质性，不同分子标志及治疗时间节点的CLCSC表型有着显著差异，其内在机制及临床意义不明。本课题将在大量前期工作基础上1）开发及优化基于免疫磁珠微流控芯片技术的新型CLCSC分选系统；2）筛选及鉴定不同分子标志及节点CLCSC，分析其与肝癌预后的相关性；3）利用单细胞转录组扩增测序技术，筛选CLCSC特征性基因表达谱及相关活化分子信号通路并明确鉴定，结合临床基因芯片数据库得到术后复发预测特异性分子标签；4）研究可特异针对肿瘤干细胞的纳米药物NanoHHI对CLCSC的作用及其机制。通过本研究可初步阐明CLCSC的异质性分子机制及其在肝癌转移复发中的作用，为临床提供新的肝癌复发预测手段及干预策略。

本课题研究期间，我课题组依托癌变与侵袭原理教育部重点实验室及卫生部重点学科中山医院肝肿瘤外科，在既往肝癌干细胞相关研究基础上，除基本完成既定研究目标外，还将相关研究及成果纵向延伸至临床，揭示了肿瘤相关靶标对患者早期诊断、预后评估及治疗的指导意义。. 1）我课题组前期研究中证实：EpCAM+ CTC具有肿瘤干性标记物，每7.5ml血EpCAM+ CTC≥2是肝癌术后预后早期复发、预后不良的标志。基于前期基础，我课题组通过PCR技术对患者血循环肿瘤细胞检测辅以流式细胞仪检测血Treg/CD4+水平两个指标进行检测，EpCAM+ CLCSC 2-ΔΔCq≥2.2或血Treg/CD4+ <5.07 %标志着患者预后不良。两指标结合可以以对患者预后做出良好判断。. 2）建立CLCSC 特异性基因表达谱及复发预测分子标签.表达谱建立后，我们验证了部分分子标签，发现了HOXB7、DDK1、Apolipoprotein A1、pIgR等分子靶标对肝癌侵袭、转移、耐药等生物学特性的影响，以及对复发和生存的预测作用。. 3）探索CLCSC 有效干预策略及机制. i.发现新型纳米Hedgehog通路抑制剂NanoHHI可以通过抑制NF-kB/p65通路诱导肿瘤细胞凋亡，同时降低MMP9从而抑制肿瘤的增殖及转移，与索拉菲尼联用后可增强索拉菲尼对肝癌细胞的杀伤作用，大幅度降低CD133+CLCSC的比例。. ii. 基于以上研究成果，研究人员对于pIgR/p-Yes这个亚群提出了针对性的靶向治疗策略(Dasatinib/MEK抑制剂)，并在肝癌病人来源的PDX模型研究中进行了验证，Dasatinib/MEK抑制剂可以显著抑制pIgR/p-Yes双阳性亚群的肿瘤生长。