黄牛Leptin 基因及其调控途径重要基因遗传特性及网络关系研究

Leptin作为调节能量平衡的重要激素，可通过NPY(神经肽) 递质系统和MC4(黑皮素4)受体系统，分别在低和高Leptin水平时发挥作用，而下丘脑弓状核是哺乳动物能量稳态调控的重要整合中枢。人和模式动物的研究表明，弓状核内NPY、POMC家族基因是采食和能量稳态调控的重要基因。本研究拟采用DNA测序法、PCR-SSCP、PCR-RFLP等SNP检测技术研究这些重要基因的遗传多样性，寻找与肉牛生长发育、肉品质密切相关的新DNA标记。同时，采用实时定量PCR技术研究这些基因的时空表达规律及其与营养水平的互作规律，采用离体细胞培养和酵母双杂交等技术研究重要基因及其编码蛋白的功能关系。通过本研究，可初步阐明Leptin、NPY、POMC家族基因及其表达蛋白的相互关系，为营养因子调控能量平衡提供理论依据，发现与肉牛生长发育和肉品质相关的新DNA标记。

本研究目的在于从DNA分子水平初步揭示与生产性状相关的基因（leptin 、gdf8、垂体转录生长因子、ANGPTL6、PAX7、DGAT2）的分子遗传特征，利用PCR-SSCP、PCR-RFLP和混合DNA池测序法分析技术研究了南阳牛、秦川牛、郏县红牛、西镇牛、鲁西牛和荷斯坦牛群体的遗传变异，并以肉牛体重、体尺性状作为衡量牛生长发育性状的指标，运用最小二乘拟合线性模型，分析了Leptin、GDF-8、Pit-1、ANGPTL6、PAX7、DGAT2基因多态位点与牛生长发育性状的关系；同时，对NPY、DGAT2、Myf5基因进行了原核表达载体的构建，并对鲁西牛的leptin受体和POMC基因进行了克隆和生物信息学分析，并就leptin基因和leptin受体基因在鲁西牛不同组织的差异表达进行了研究。.通过研究表明：检测到鲁西牛ANGPTL6 基因内含子中3 个新的SNPs。.利用 DNA 池测序和 PCR-RFLP 技术系统检测了黄牛 Pax7 基因所有编码区和部分内含子区共 9 个基因座（P1-P9）在 5 个黄牛群体（南阳牛、郏县红牛、秦川牛、鲁西牛和草原红牛）中的遗传变异。试验中共检测到 5 个 SNPs：NC_007300: g.332 ins/del G,g.3531G>A, g.56626G>A, g.66117C>T 和 g.66251A>G，分别位于 Pax7 基因的内含子1、外显子3、外显子5、外显子7 和内含子7。.成功克隆了鲁西牛leptin受体和POMC cDNA全长序列，并进行了相关的生物信息学分析。结果显示：预测到鲁西牛leptin受体氨基酸序列有47个磷酸化位点，POMC有12个磷酸化位点；两蛋白都具有信号肽序列。 氨基酸序列中含α-螺旋、β-折叠，β-转角及无规卷曲4种二级结构。leptin和leptin受体基因在鲁西牛不同组织表达差异的研究初步结果显示：Leptin基因在鲁西牛的心、肺表达量最高，在肝脏几乎不表达，leptin与leptin受体表达水平呈负相关。.本研究发表期刊论文7篇，其中SCI收录5篇与国内外同类研究相比，该项目的总体研究水平达到国内外同类研究的先进水平。从DNA水平对中国地方优良黄牛品种进行了分子遗传研究，为寻找可用于标记辅助选择的分子标记、生物分子选种和地方良种鲁西牛组织表达差异研究提供参考。