ZO蛋白在HCV感染扩散中的作用及其机制研究

最近发现紧密连接（tight junction, TJ）蛋白参与HCV的入胞过程，为认识丙型肝炎的感染发病机制带来了新视角。TJ是相邻上皮细胞间的特殊结构，主要作用在于构成通透性屏障及维持细胞膜上脂质和蛋白质的空间分布，对于肝脏的正常功能必不可少；ZO蛋白作为"脚手架"可募集其他分子到TJ结构，起枢纽作用。本研究以ZO蛋白为切入点，选择HCV受体、TJ结构及细胞骨架为研究对象，培养具有成熟TJ的细胞，利用HCVcc及HCVpp感染，观察上皮细胞屏障功能及通透性的变化，检测HCV感染后ZO蛋白、HCV受体、细胞骨架的变化及其调控因素，了解ZO蛋白相关信号转导分子的改变，探索ZO蛋白在HCV细胞间扩散过程中的作用，分析ZO表达对HCV感染性的影响，揭示ZO与HCV感染之间的内在关系，阐明影响HCV在细胞间扩散的因素，有望进一步揭示HCV的感染发病及慢性化机制，为开发新的丙肝治疗策略提供依据。

紧密连接（tight junction, TJ）蛋白参与HCV的入胞过程，这为认识丙型肝炎的感染发病机制带来了新视角。TJ是相邻上皮细胞间的特殊结构，主要作用在于构成通透性屏障及维持细胞膜上脂质和蛋白质的空间分布，对于肝脏的正常功能必不可少；ZO蛋白作为“脚手架”可募集其他分子到TJ结构，起枢纽作用。本研究构建了HCV体外培养体系，培养具有成熟TJ的细胞，通过抑制ZO-1的表达，观察上皮细胞屏障功能及通透性的变化，并检测HCV感染后ZO蛋白、HCV受体表达的变化，了解ZO蛋白相关信号转导分子的改变，探索ZO蛋白在HCV细胞间扩散过程中的作用。.本课题成功在体外培养并得到了具有感染性的HCV病毒颗粒，为体外研究HCV的感染提供稳定可靠的模型。在Transwell培养皿上培养出具有成熟极化结构的Huh-7及Caco-2单层上皮细胞，是较好的模拟体内肝细胞之间极化结构的模型，为进一步研究紧密连接结构与HCV感染之间的相关性奠定了基础。采用化学合成的ZO-1 siRNA序列，可有效抑制ZO-1蛋白表达，细胞之间通透性发生明显变化，跨膜电阻降低，FD-4通透性增加。正常情况下细胞上的claudin-1主要呈线状表达于细胞之间的边界区域，HCV受体occludin及CD81与claudin-1的定位一致，共同表达于细胞间的边界。ZO-1被抑制后，TJ结构破坏，HCV受体分布发生变化，HCV易接触位于TJ处的受体，感染性明显增强。.收集相关正常肝脏及丙肝患者肝脏标本，并检测紧密连接蛋白的表达情况，与正常肝脏组织比较，丙肝患者肝脏ZO-1表达降低，occludin表达略有增加。丙肝患者HCV受体与正常对照相比，其表达降低、定位发生变化。.将已感染HCV的细胞与未感染的细胞共培养，检测ZO-1在HCVcc细胞间扩散的作用。研究发现，如将ZO-1用siRNA抑制，核心抗体阳性的细胞比例会明显增加，说明抑制ZO-1的表达以后，HCV在细胞间更容易发生扩散。.通过本项目的研究发现，正常情况下ZO在细胞的表达影响HCV的感染性，而HCV感染细胞后，紧密连接及HCV受体的表达及定位也发生相应的变化。可能与以下两方面有关1.丙肝病毒感染破坏紧密连接结构，易于与受体结合并在肝细胞间扩散；2.机体对丙肝病毒感染后做出相应的改变，阻止丙肝病毒进一步感染。此外，ZO蛋白在细胞间扩散也发挥一定的作用。