肿瘤相关巨噬细胞调控三阴性乳腺癌自噬活性促进其侵袭及转移的机制研究

The invasion and metastasis mechanism of triple negative breast cancer (TNBC) is a pressing problem. Recently, some researches have shown that tumor-associated macrophage (TAM) can promote invasion and metastasis of tumor. Our previous study found that, there were strong positive correlations among TAM numbers, autophagy activity and metastasis of TNBC patients. Further in vitro experiments found that: after co-cultured with TAM, migration and invasion TNBC cells significantly enhanced; membrane receptors IL1R/TNFR expression increased; NF-κB pathway activated; and autophagic activity increased. Thus, we propose the hypothesis: cytokines IL1β/TNFα secreted by TAM can activate IL1R/TNFR—IKK/NF-κB—autophagy pathway of TNBC, thereby promote the invasion and metastasis of TNBC. We intend to test this hypothesis by establishing relevant cell and animal models, combining with clinical studies, and applying with the techniques of molecular and cell biology. In addition, we plan to use of antibodies and gene interference technique to attack this pathway, and to explore the possibility for inhibiting invasion and metastasis of TNBC. These experiments will provide a solid foundation for clinical translational research. This study investigates that TAM promotes invasion and metastasis of TNBC from a new angle. So it can provide new therapeutic strategies for curbing invasive and metastatic of TNBC and improve outcomes of patients.

明确三阴性乳腺癌(TNBC)侵袭及转移机制是一个亟待解决的难题。最新研究表明肿瘤相关巨噬细胞(TAM)可促进肿瘤侵袭及转移。我们前期临床研究证实TNBC患者组织TAM数量、肿瘤细胞自噬活性和转移间呈现正相关。体外细胞实验发现：TNBC细胞与TAM共培养后,迁移及侵袭能力增强；膜受体IL1R/TNFR表达增高；NF-κB通路激活；自噬活性增强。由此我们推测:TAM分泌细胞因子IL1β/TNFα,激活TNBC细胞IL1R/TNFR—IKK/NF-κB—自噬通路，从而促进其侵袭及转移。我们通过建立相关细胞及动物模型,并结合临床研究，应用分子及细胞生物学等多种技术验证此假说。采用抗体中和,基因干扰等方法靶向攻击该通路，探讨抑制TNBC侵袭及转移的可能性,为临床转化研究提供坚实的实验基础。本研究从全新角度探讨TAM促进TNBC侵袭及转移机制,从而为早期遏制TNBC进展,改善患者预后提供新的治疗策略。

对于三阴性乳腺癌（TNBC）的侵袭转移机制的研究，以往主要关注于肿瘤细胞本身的病理变化，而忽略了其所处的肿瘤微环境的重要性。本课题组围绕TNBC细胞自身特征变化以及其所处微环境中肿瘤相关巨噬细胞（TAM）改变这两方面，开展了一系列深入性的研究。课题组前期实验研究结果显示肿瘤微环境中的TAM在TNBC进展过程中发挥着至关重要的作用。但其作用机制尚不明确。我们通过建立相关细胞及动物模型,并结合临床研究，应用荧光定量PCR、免疫组化、酶联免疫吸附测定和WB等多种分子及细胞生物学技术进行研究探索。体外细胞实验结果显示诱导THP-1获得M2型巨噬细胞（TAM），与TNBC 细胞（MDA-MB-231、MDA-MB-468）共培养后,TNBC 细胞中自噬体数量明显增加，自噬标记蛋白Beclin1，LC3II 以及ATG5 表达水平明显增加，并可促进TNBC细胞增殖和侵袭能力。研究数据还显示：与TAM共培养后，TNBC细胞膜受体TNFR /IL1R 表达水平增加，细胞因子IL1β/TNFα水平升高。NF-κB 通路IKK 与NF-κB 表达增加，并均与自噬标记蛋白Beclin1，LC3II 以及ATG5 表达水平呈正相关。应用特异性抗体或抑制剂阻断IL1R/TNFR—IKK/NF-κB通路后，TNBC细胞自噬活性显著降低，增殖及侵袭能力减弱。提示TAM通过分泌细胞因子IL1β/TNFα,激活TNBC细胞IL1R/TNFR—IKK/NF-κB通路，进而诱导自噬，从而促进其增殖和侵袭能力。临床数据亦证实TNBC 患者肿瘤组织中的TAM标记蛋白表达水平与自噬标记蛋白表达水平呈正相关。自噬标记蛋白LC3II，Beclin1表达水平与TNBC患者肿瘤大小，淋巴结转移及Ki-67表达呈正相关，与患者预后呈负相关。可作为TNBC的预后的生物标记物。在此基础上，课题组亦发现自噬标记蛋白LC3II，Beclin1 表达平与结直肠癌的临床分期以及预后密切相关。综上所述，我们的研究结果不仅阐明了TAM通过分泌IL1β/TNFα作用于IL1R/TNFR -IKK/NF-κB通路诱导TNBC细胞自噬而促进其侵袭及转移的机制，并证实自噬标记蛋白LC3II，Beclin1可以作为三阴性乳腺癌以及结直肠癌临床分期，以及预后等方面的生物标记物。为今后着眼于该类肿瘤的靶向生物治疗提供了新的依据。