基于转录组测序的假微型海链藻硅吸收与生物硅化相关功能基因研究

Due to the significant role in the marine ecosystem and its unique and exquisite silicon cell walls, diatom has attracted lots of attentions from scientists to figure out the procedure and internal molecular mechanism involved in the silica uptake and bio-mineralization process during diatom morphogenesis. In this project, the function genes involved in silica uptake and bio-mineralization process of a marine diatom Thalassiosira pseudonana, including their expression and molecular mechanism, will be investigated based on the transcriptome sequencing (the digital gene expression profile). Firstly, the microscopy morphological characters and physiological features of T. pseudonana cells at the different stages, such as silicon starvation stage, silicon absorption period, valve formation and girdle bands formation phases, will be described respectively by the fluorescence, scanning and atomic force electronic microscope observation. Secondly, the high-throughput sequencing at the transcriptome level will be carried out in order to obtain the relevant genes and their expression profiles at all above different stages during the silica uptake and bio- - mineralization process. After important functional genes are identified, we will attempt to further determine the function of one or two important functional gene of interest using the gene knock out or RNA interference technology. Finally the genes and their regulation mechanism involved in marine diatom silicon absorption and bio-mineralization processes will be revealed. This project is expected to give us a new insight into this special life process of marine diatom known as silica uptake and bio-mineralization, and also give us a deeper understanding of diatom survival and competition strategy and its role and the great significance in element biogeochemistry cycling and biological evolution.

基于硅藻在海洋生态系统中的重要地位以及它独具特色的硅质细胞壁，人们对硅藻硅吸收与生物硅化过程及其调控机理产生了极大的兴趣，成为当今研究热点。本项目拟以假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)为研究对象，采用转录组测序技术，从转录组水平研究与硅吸收与生物硅化相关的基因及其表达，探讨相关功能基因的作用与调控机制。首先通过荧光、扫描和原子力电子显微镜观察，研究目标硅藻硅吸收与生物硅化过程的形态和生理学特征；其次采用转录组测序（数字基因表达谱）对硅吸收与生物硅化各个功能状态下的全转录本进行高通量测序，获得相关基因的动态表达；再进一步采用基因敲除或RNA干扰技术，对其中1-2个重要功能基因进行功能验证。最后阐明海洋硅藻硅吸收与生物硅化作用的相关基因、调控机理和生态意义。研究结果将有助于对这一特殊生命过程的深入了解，揭示海洋硅藻的生存与竞争策略及其在物质循环和生物进化中的意义。

基于海洋硅藻在海洋生态系统中的重要地位以及它独具特色且精美绝伦的硅质细胞壁，人们对硅藻硅吸收与生物硅化过程及其内在调控机理产生了越发浓厚的兴趣，成为当今一个研究热点。本项目以假微型海链藻（Thalassiosira pseudonana）为研究对象，采用iTRAQ蛋白质组学、新一代高通量转录组测序技术（RNA-Seq）、生物信息学方法，基因表达分析以及转基因技术，从蛋白组学和转录组水平研究了与海洋硅藻硅吸收与生物硅化相关基因和蛋白，获得了相应的表达图谱，探讨了相关功能基因的作用和调控机制。主要结果如下：首先通过荧光标记和显微镜观察，研究假微型海链藻硅吸收与生物硅化过程的形态学特征，确认了不同状态下（例如硅缺乏、硅吸收期、壳面形成期、壳环带形成期等）的特点。提取了硅质细胞壁形成过程对应不同关键时间点的细胞总蛋白和总RNA，进行了蛋白组学和转录组水平的全测序，获得了全蛋白表达图谱和全基因转录表达图谱。获得与硅吸收与硅化相关的差异蛋白165个，重点分析了周期蛋白、硅转运蛋白、囊泡包被蛋白的相关功能。获得11个已知硅吸收与生物硅化相关基因的表达模式以及它们共调控基因282条。研究了目标硅藻在硅吸收和细胞壁形成过程的全基因转录本的多聚腺苷化动态变化，揭示了硅吸收与生物硅化相关基因的转录后调控。采用生物信息学、基因表达分析以及转基因等方法重点研究了19个未知共调控基因（潜在与硅吸收与硅化密切相关的基因）的结构和功能。发现它们具有相似的结构域特征，其中2个与细胞硅吸收蛋白SIT2共调控，9个与环带蛋白CinY2共调控，8个与细胞壁蛋白Fru1共调控。它们的表达分别与硅吸收、环带或壳面合成过程，以及硅在细胞外、细胞内、细胞壁上的含量密切相关。转基因技术进一步验证未知基因3是参与调节硅转运过程的一个重要基因。研究结果发现，硅藻进行硅吸收以及生物硅化过程是一个多基因，多蛋白共同参与的一个复杂过程。研究结果有助于人们对硅藻硅吸收与生物硅质化这一特殊生命过程的深入了解，揭示了海洋硅藻的生存与竞争策略及其在生物地球化学循环和生物进化中的意义。