NLRP3炎症小体介导的干眼氧化损伤所致的炎症机制研究

Dry eye syndrome (DES), the second top eye disease in the outpatients, is a multifactorial disease with potential damage to the ocular surface. It is accompanied by increased osmolarity of the tear film and inflammation of the ocular surface, and the inflammation is the most accepted mechanism of DES, while the oxidative stress is also discovered to be related to DES, It has been reported that excessive ROS stimulates NLRP3 to form NLRP3 inflammasome, which activates the maturation and secretion of IL-1β and IL-18 cytokines. And we presume that this is the way how oxidative stress triggers inflammation in DES. This study uses a dry eye mouse model induced by single environmental factor, which was established in our lab, to investigate the expression of ROS, NLRP3 inflammasome components (NLRP3, ASC, Caspase1), and inflammatory factors (IL-1β, IL-6, and IL-18) in mouse ocular surface with or without the use of ROS inhibitor N-acetyl-L-cysteine (NAC). And the expressions of these factors are also investigated in cultured human permanent corneal epithelial cells and primary conjunctival epithelial cells in high-osmolality media. Then the treatments of knock-down and knock-up of NLRP3 in these cells are performed to validate the effect of NLRP3 system in the development of DES.

干眼是眼科门诊患者中的第二大眼病，目前认为其核心发病机制是泪液高渗和免疫炎症反应，然而干眼患者眼表组织中高渗引起的氧化损伤也日益被重视，但这三者在干眼发病过程中的相互关系尚不明确。最近研究发现，细胞氧化损伤中过多的ROS，通过激活NLRP3炎症小体，而引发炎症反应。据此，我们认为干眼可能是由于泪液高渗产生的ROS激活眼表的NLRP3炎症小体进而激发炎症反应，最终导致干眼发病。本课题利用单纯环境因素诱导的小鼠干眼模型，研究其眼表的ROS、炎症小体（NLRP3、ASC、Caspase1）和炎症因子（IL-1β、IL-6、IL-18 等）的表达，并通过氧化损伤抑制剂反向验证；其次，体外培养角膜和结膜上皮细胞，观察其ROS、NLRP3炎症小体和炎症因子对高渗透压的反应，并通过上调和下调NLRP3的表达，深入研究其在干眼发病中的机制。

干眼是以免疫炎症反应为重要特征的眼表疾病，ROS所致的氧化损伤是干眼发病的另一关键相关因素，但是眼表环境中ROS与免疫炎症是否存在一定关系至今未有报道。本研究依据ROS生成过度能通过激活NLRP3组合生成NLRP3炎症小体，进而活化分泌IL-1β的这一基础理论，在ICES小鼠干眼模型、人角膜上皮细胞株及临床外环境性干眼病人样本中，利用Real-time PCR、共聚焦免疫荧光、ELISA及Western blot等细胞分子生物学技术，探究了ROS、NLRP3炎症小体和活性IL-1β在干眼发病早期的各自地位及重要作用，并得出了以下结果： .1) ROS在干眼病程的早期即有明显的增多，且其发生在时间上早于NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β基因水平的上调，是干眼发病的始发危险信号； .2) NLRP3是识别ROS信号刺激的胞内模式受体，NLRP3通过与ASC、Caspase-1聚合形成NLRP3炎症小体，来活化分泌促炎症因子IL-1β，进而启动干眼后续的炎症反应； .3) ROS-NLRP3-IL-1β信号通路可能是外环境性干眼早期的启动程序； .4) NLRP3存在于人角膜、结膜上皮细胞中，它对干眼发病的重要作用说明先天性免疫反应参与了干眼疾病的发生； .5) ROS抑制剂能清除干眼始发阶段的危险信号ROS，有显著的治疗和预防干眼发生的作用，为干眼的病因性治疗提供可能。.6)在原代人角膜上皮细胞中高渗或氧化应激可以激活TRPM2，并上调NLRP3炎症小体和IL1β的表达。