猪流行性腹泻病毒N蛋白调控宿主天然免疫的分子机制研究

Porcine epidemic diarrhea is one of the most important infectious disease in pig industry caused by porcine epidemic diarrhea virus (PEDV). The infection of PEDV is capable to down-regulate type I interferon (IFN), inhibiting natural immunity. It is believed that the proteins of PLP2 and nucleocapsid of PEDV antagonize against IFN, while its molecular mechanism is not known yet. This study is aiming to understand the novel biological functions of PEDV structural proteins based on the signaling pathway of IFN, especially JAK-STAT: the regulation of nuclear translocation protein including KPNA1and the impact on its ubiquitination, the regulation of ISGF3 nuelear translocation and the expression of PKR, OAS, thereby to elucidate the molecular mechanism of the nucleocapsid of PEDV on regulating type I IFN. Therefore, the objective of the study is to reveal the pathogenesis of PEDV, which induces natural immunosuppression, and to acquire more knowledge on biological characteristics of nucleocapsid of coronaviruses.

猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的猪流行性腹泻是危害养猪业的重要传染病之一。PEDV感染机体后能够引起机体I型干扰素（IFN）下调从而抑制机体的先天性免疫应答。目前研究认为PEDV的PLP2和N蛋白有IFN拮抗活性，但对其分子机制的研究仍不透彻，这极大地限制了对PEDV致病机制的深入研究。本研究采用分子生物学、免疫学等方法拟从IFN发挥效应的信号通路尤其是JAK-STAT信号通路来探索PEDV结构蛋白N的生物学新功能：N蛋白对I型IFN信号通路中对核转运蛋白KPNA1的调控，对三聚体复合物ISGF3入核效应的影响，对I型IFN效应蛋白PKR、OAS表达水平的影响及对核转运蛋白泛素化水平的影响，进而从不同角度阐明PEDV 结构蛋白N调控I型IFN信号通路的分子机制。该项目的研究不仅能从新的角度揭示PEDV感染导致天然免疫抑制的致病机理，也能提升对冠状病毒结构蛋白N生物特征的认识。

猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的猪流行性腹泻是危害养猪业的重要传染病之一。PEDV感染机体后能够引起机体I型干扰素（IFN）下调从而抑制机体的先天性免疫应答。目前研究认为PEDV的PLP2和N蛋白有IFN拮抗活性，但对其分子机制的研究仍不透彻，这极大地限制了对PEDV致病机制的深入研究。设计方案共转化N 基因重组质粒与KPNA1、KPNB1基因重组质粒，考虑到根据KPNA1、KPNB1外源基因表达判定其影响，不可靠。方案调整：通过酵母双杂交方法验证N蛋白与KPNA1、KPNB1蛋白是否有相互作用，实验结果是N蛋白都没有相互作用，因此判定研究意义不大。探讨研究新的研究课题，最终确定研究课题为应用酵母双杂交系统筛选猪流行性腹泻毒N蛋白互作的宿主蛋白及其对PEDV 的影响。.本研究采用分子生物学、免疫学、酵母双杂交和CoIP等方法筛选出PEDV互作的蛋白FTH1、CORO1C、LGALS3、SNRPG、KRTAP5-3、和ZNF598。酵母共转化试验和CoIP方法验证PEDV N蛋白与LGALS3、SNRPG的相互作用。PEDV N蛋白与LGALS3，SNRPG蛋白相互调控，过表达LGALS3和SNRPG促进病毒增值，病毒感染细胞抑制LGALS3和SNRPG表达。同时证实PI3K/AKT/GSK3/β-catenin信号通路是调控PEDV复制的信号通路之一。