抗NRP-1b1/b2单克隆抗体抗肿瘤活性与机理研究

NRP-1是一个多功能受体，在肿瘤新生血管形成与肿瘤细胞迁移黏附侵袭等方面起非常重要调控作用，是一个很有希望的新靶标。本项目旨在发展靶向NRP-1的抗体药物，拟在前期已获得一组抗人源NRP-1b1/b2单克隆抗体基础上，筛选可以选择性阻断VEGF165结合NRP-1的功能性抗体，分析该抗体与NRP-1结合的位点，检测其对血管内皮细胞和肿瘤生物学行为的影响，分析抗体对NRP-1相关信号通路调控的分子机制，观察其对肿瘤动物模型的治疗作用，探讨其抗肿瘤机理。本研究结果将进一步丰富有关NRP-1抗原表位组学和抗体药物组学的理论知识，为新靶标NRP-1的抗体药物发展提供新思路。

NRP-1是一个多功能受体，在肿瘤新生血管形成与肿瘤细胞迁移、黏附和侵袭等方面起非常重要调控作用，是一个很有希望的肿瘤治疗新靶标。本项目研究靶向NRP-1b1b2结构域的功能性抗体及其抗肿瘤作用的分子机制。RT-PCR从胃癌BGC-823细胞株中获取NRP-1b1b2基因， NRP-1b1b2-pET22b(+)重组载体表达于E.coli Rosetta细胞，纯化的NRP-1b1b2融合蛋白作为免疫原。细胞融合技术建立抗NRP-1b1b2单克隆抗体杂交瘤库，ELISA筛选获取一株能选择性阻断VEGF165结合NRP-1的功能性抗体（A6），ELISA、Western blot、co-IP和IHC结果显示A6可特异、高亲和力地结合rhuNRP-1b1b2；同时，也能捕获野生型NRP-1，并可用于肿瘤组织细胞NRP-1的定位与定量检测。竞争ELISA和Dot-ELISA分析显示NRP-1b1b2肽段不能抑制A6与NRP-1b1b2蛋白结合，提示A6结合位点不是NRP-1b1b2抗原的线性表位，而是构象表位。. 大鼠角膜新生血管模型实验显示A6对新生血管的生成具有抑制作用，并呈量效和时效关系。抗肿瘤活性实验证明A6对胶质瘤U87、胃癌BGC-823、乳腺癌MCF-7和结肠癌SW480细胞株的生长、迁移、侵袭均有显著抑制作用；动物人移植瘤模型治疗实验显示A6能抑制胶质瘤和胃癌裸鼠移植瘤的生长。生长抑制与凋亡实验证明A6可诱导SW480细胞凋亡、阻滞细胞周期于S期。Western blot揭示A6处理后SW480细胞的Bax、caspase-3蛋白表达上调，Bcl-2、PI3K(85)、p-Akt表达下调。结果表明A6对SW480的生长抑制与凋亡作用与下调PI3K/Akt信号通路相关。细胞粘附实验证明A6对MCF-7的粘附有显著抑制作用，共聚焦荧光显微镜观察和Western blot发现A6抗体能抑制粘附的MCF-7细胞应力纤维的重排、抑制NRP-1与整合素α5β1形成复合物、下调FAK、p130cas和Erk1/2的磷酸化水平。实验结果表明A6对MCF7粘附的抑制与其阻断α5β1-NRP-1/FAK/p130cas的信号通路有关。. 本项目研究结果阐明了靶向NRP-1b1b2抗体的抗肿瘤活性与分子机制，也为新靶标NRP-1的抗体药物发展提供了新思路。