EphrinA调控Müller细胞诱导分化为感光细胞的研究

视网膜色素变性是临床常见的遗传性致盲性眼病，目前缺乏有效的治疗方法。研究发现，视网膜的Müller细胞在特定条件下，可以去分化成视网膜干细胞，重新进入细胞周期，增殖并分化为视网膜感光细胞。本研究旨在探究视网膜内源性环境因素对Müller细胞增殖及分化能力的影响。最近的研究表明，ephrinA分子对成年哺乳动物中枢神经干细胞增殖分化能力具有抑制性的调控作用，本人的前期工作也证实ephrinA对成年睫状体上皮细胞来源的视网膜干细胞的增殖和分化也具有抑制性调控作用，本课题拟通过敲除ephrinA2和ephrinA3双基因后，研究视网膜色素变性模型- - rhodopsin基因敲除鼠的Müller细胞的增殖及再生为感光细胞的情况，从而阐明视网膜内源性环境因素ephrinA对Müller细胞增殖及分化能力的调控作用，并进一步探讨其作用的分子机制，为视网膜色素变性寻找新的治疗途径。

视网膜色素变性是临床常见的不可逆致盲性眼病，主要病理特点是感光细胞的变性凋亡，目前对视网膜色素变性缺乏有效的治疗方法。近年来干细胞的研究发现Müller细胞可作为内源性视网膜干细胞的来源，而本研究旨在研究内源性分子ephrinA2/A3对Müller细胞增殖分化为感光细胞的调控作用。本研究首先利用western blot检测发现随着视网膜发育成熟，ephrinA2、A3的表达逐渐上调，其表达趋势与Müller细胞增殖能力丧失的趋势相一致。并且免疫组化证实ephrinA2、A3在Müller细胞上均有表达，提示ephrinA2/A3可能参与Müller细胞增殖分化能力的调控。我们利用ephrinA2/A3基因敲除小鼠和野生型小鼠为模型，体外培养两种小鼠的Müller细胞，并且用BrdU增殖实验证实ephrinA2/A3基因敲除小鼠的Müller细胞具有更强的增殖能力。RT-PCR检测发现，ephrinA2/A3基因敲除小鼠的Müller细胞表达更高水平的干细胞标记物，如math1、math5、wnt1、wnt3a等。我们将两种Müller细胞培养成神经球后，再利用神经分化实验检测Müller干细胞在体外分化为感光细胞的能力，证实Müller干细胞在体外可以分化为感光细胞，并且ephrinA2/A3基因敲除小鼠的Müller干细胞分化为感光细胞的数量更多效率更高。我们利用视网膜色素变性的动物模型rhodopsin-/-作为疾病模型，并且杂交繁育(rho-/-ephrinA2-/-A3-/-三基因敲除小鼠)，体内实验比较其与rho-/-小鼠体内Müller细胞增殖分化为感光细胞的能力。首先通过OCT活体观察同日龄的两种小鼠的外核层厚度发现三基因敲除小鼠的外核层厚度更厚，并且用冰冻切片测量外核层厚度发现了一致的结果。BrdU活体标染发现三基因敲除小鼠的视网膜内增殖细胞数量明显高于rho-/-小鼠，而且发现在内核层内有BrdU/Ki67共标染的细胞，推测为增殖的Müller细胞，并且观察到外核层有BrdU阳性的感光细胞，推测可能为Müller细胞增殖分化感光细胞并移行到外核层。总之，该研究从体内及体外证实了ephrinA2/A3对Müller细胞增殖及分化能力的抑制性作用，从而加深了对Müller细胞增殖分化机制的理解，为视网膜色素变性疾病的治疗发现了一个新的治疗靶点。