Intraflagellar Transport运输纤毛蛋白的分子机理

Cilia/flagella are hair-like organelles emanating from the cell surface of most of eukaryotic cells. Their assembly and disassembly are dependent on Intraflagellar Transport (IFT). IFT is composed of IFT-A complex and IFT-B complex, IFT-A is driven by a microtubule minus motor dynein-2 and transports the turnover products out of cilia, IFT-B is motivated by a plus microtubule motor Kinesin-2 and moves the axonemal precursors into the cilia, but the mechanism of the IFT in transporting the cargos is unknown. We plan to identify all of the cargos of IFT by using the quantitative proteomic approach and analyze the motility behavior of the putative cargos using the FRET method. We proposed two models: "Carrying Model" and "Ubiquitin-labeling Model" and will testify these models by using the Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) and Immunoprecipitation (IP) methods. These works will speed our understanding the regulation of the interaction between the IFT and cargos and the mechanism of cilia enriching a subset of proteins in different types of cells.

纤毛/鞭毛分布在大多数真核细胞的表面，具有运动和感受功能。纤毛的形成和解聚依赖鞭毛内运输机制Intraflagellar Transport (IFT)。IFT包含由Dynein-2驱动的IFT-A复合体和kinesin-2驱动的IFT-B复合体，目前认为IFT-A将纤毛内的蛋白运出纤毛，而IFT-B 将蛋白由细胞内运入纤毛，但纤毛内所有蛋白是否都依赖IFT运输、被IFT运输的货物在纤毛中的运动特点以及IFT运输蛋白货物的机理都不清楚。本项目将利用定量蛋白质组学的方法全面地鉴定被IFT运输的货物；研究被IFT-A和被IFT-B运输的货物在纤毛中的运动特点；将运用荧光共振能量转移(FRET)等方法验证申请人提出的两种IFT与货物相互作用的假说："携带假说"和"泛素标签假说"。这些研究将为阐明IFT与货物相互作用的调控打下基础， 有利于了解纤毛在不同细胞中富集特殊的蛋白分子的机理。

纤毛是突出在真核细胞表面的细胞器，执行着重要的运动、感觉和分泌功能。纤毛中蛋白有一千种左右，但纤毛内不存在蛋白质合成的核糖体，目前所知大部分纤毛蛋白需要纤毛内运输Intraflagellar Transport（IFT）运入或运出纤毛，但IFT选择性的运输纤毛蛋白的分子机理还不清楚，在国家自然科学基金的资助下，对这一问题的深入研究得到了以下成果：.1..IFT-B 蛋白复合体在基体的组装机理.纤毛的形成、解聚和信号转导依赖于纤毛内运输IFT，90%的IFT蛋白定位于基体。利用IFT46为例证明IFT46的基体定位序列，也是纤毛的定位序列。IFT46 的基体定位依赖于IFT52，二者在细胞质中形成复合物，然后定位于纤毛基体，这些结果表明IFT各个亚基和货物可能先形成复合体，然后定位于基体，推翻了以前“IFT各个亚基和货物在基体组装，然后进入纤毛”的假说。.2. 反向IFT与纤毛解聚货物的相互作用机理.利用遗传学、蛋白质组学和生物化学等方法证明纤毛解聚起始后，纤毛内泛素化系统在轴丝上的a-tubulin的K304位点上加上K63多聚泛素链，从轴丝上解聚的带有多聚泛素链的a-tubulin与IFT-A复合体中的IFT139相互作用，被retrograde IFT运回到细胞体中重新利用。.3.衣藻正向和反向遗传学平台的建立.由于CRISPR/Cas9技术在衣藻中还不成熟，我们建立了衣藻随机插入失活突变体库，含有15 万个突变体库，并建立高效的筛选流程。目前利用该突变体库已筛选到突变体26个，对应20个目的基因。同时我们还得到近千个纤毛和油滴形成突变体。为研究纤毛和油滴的形成机理打下了基础。目前已向其他实验室提供衣藻突变体15个。另外我们还建立了基于miRNA的高通量基因敲降技术。.4. 斑马鱼 bloc1s基因的功能研究.纤毛膜蛋白如Polycystin-2的运输依赖于lysosome-related organelles complex-1（BLOC1），为了证明IFT与BLOC1一起参入运输纤毛膜蛋白，我们建立了BLOC1复合体缺陷而导致的Hermansky-Pudlak综合症的斑马鱼模型，发现BOOC1参与色素运输和鱼鳔形成，揭示了bloc1s1基因在鱼鳔的表面活性物系统形成过程中具有不可或缺的作用，这也是首次关于鱼鳔表面活性物系统的特征描述和机制研究。