WRKY28和WRKY43调控葡萄耐寒的分子机理研究

Improvement of cold tolerance is one of the important goals in our grape breeding. The mechanism that how grape, especially the cold-hardiness species, Vitis amurensis respond to cold-stress has gradually become a spotlight. Supported by last project, we compared the changes of trancriptome under cold treatment in V. amurensis and V. vinifera cv. Muscat Hamburg. Two WRKY transcription factor family genes ( WRKY28 and WRKY43) were found accumulated quickly and largely during cold treatment in V. amurensis. Over-expression of VaWRKY28 and VaWRKY43 increased the cold tolerance in Arabidopsis. Based on these results, a series of experiments including yeast one-hybrid, suspension cell transformation, transcriptome analysis and ChIP-Seq were designed to identify the up- and down-stream genes of WRKY28 and WRKY43. Possible signal pathways that WRKY28 and WRKY43 may participate during cold-stress in grape and the reasons for its specific expression patterns in V. amurensis will be analyzed. This study can increase our understanding of cold-stress related signaling pathway in grape. It will also provides clue for understand the signal transduction during cold stress in V. amurensis and the candidate genes for the following transgenic breeding.

提高葡萄耐寒性是我国葡萄育种的重要目标。研究葡萄尤其是高耐寒的山葡萄对冷胁迫的响应机制已逐渐成为葡萄研究的热点领域。申请人在上一个项目中完成了山葡萄和欧亚种'玫瑰香'葡萄在冷处理后转录组变化比较分析，发现两个WRKY转录因子家族成员（WRKY28 和WRKY43）在山葡萄中均较早和较大量的响应冷胁迫处理；拟南芥中过表达VaWRKY28和VaWRKY43均可以增加植株的耐寒性。在此基础上，拟进一步利用酵母单杂交技术、悬浮细胞转化、转录组测序、ChIP-Seq等技术，深入挖掘冷胁迫下调控WRKY28 和WRKY43的上游基因和WRKY28 和WRKY43调控的下游基因，分析其可能参与的信号通路或代谢途径，并寻找其在山葡萄中特异表达模式的原因及其对耐寒性的影响。此研究不仅可以增加我们对葡萄冷信号通路的认识，也为进一步阐明山葡萄耐寒的分子机理和利用山葡萄特异的耐寒基因进行转基因育种提供理论依据。

本项目开展了WRKY28和WRKY43在山葡萄和欧亚种葡萄低温下表达模式成因及其抗寒调控研究。葡萄休眠芽冬季表达模式分析表明仅WRKY28的表达随温度降低而有所增加且增幅小于叶片，说明生长期器官与冬季休眠器官在低温应答方面存在差别。利用特异抗体证实VaWRK28在蛋白水平参与了低温应答。拟南芥中35S启动子驱动的VaWRKY28过表达株系抗寒性增加，且基因表达水平与抗寒性不相关。WRKY43过表达株系抗寒性未增加。VaWRKY28 定位于细胞核并能够结合W-box元件。启动子序列分析发现其含有ERF结合元件，共表达分析发现ERF092与其存在共表达模式。VaERF092和VaWRKY28均受低温和外源乙烯诱导，抑制乙烯合成能完全抑制其在低温下的表达。过表达VaERF092可增强拟南芥抗寒性。酵母单杂交、烟草叶片瞬时转化、双荧光素酶等系统证实VaERF092具有结合VaWRKY28启动子区GCC box的能力，表明低温下VaWRKY28的上调表达可能由VaERF092来调控。葡萄愈伤过表达材料冰点测定结果表明两个基因均具有增加愈伤抗寒性的能力，且过表达VaERF092确实能够增加VaWRKY28的表达。开展了拟南芥和葡萄VaWRKY28转化材料的转录组测序，为鉴定其调控的下游基因提供了线索。综上所述，VaWRKY28基因可能受到低温下乙烯诱导的VaERF092调控而上调表达，进而调控葡萄抗寒性。同时开展了WRKY12和WRKY14在低温和干旱胁迫中的功能验证。发现VaWRKY14在山葡萄中应答低温和干旱胁迫，拟南芥过表达植株抗旱性增强，转录组测序发现多个胁迫相关基因表达上调，表明VaWRKY14参与葡萄低温和干旱应答并通过对胁迫相关基因的表达调控来增加抗旱性。VaWRKY12随低温处理增高，常温下定位于细胞质和细胞核中，低温处理后向细胞核核富集，过表达拟南芥植株抗寒能力增加，转录组测序鉴定到404个差异基因(涉及代谢、转录调控等通路)，表明VaWRKY12可通过对下游靶基因的调控来增加抗寒性。项目执行期间撰写学术论文3篇(Plant cell reports,已发表；Plant Molecular Biology，已接收)。共培养博士后2名，博士1名，硕士1名。本研究拓展了对WRKY参与葡萄低温应答的认识，也为进一步揭示山葡萄抗寒旱机理提供了材料和研究方法上的借鉴。