从调节内质网应激与Sertoli细胞功能研究五子衍宗丸改善衰老睾丸生精功能减退的作用机制

The reproductive function decline and birth defects with advancing age have become an urgent issue for reproductive health. Our previous fund program demonstrated that wuziyanzong pills significantly improved the spermatogenic impairment induced by cyclophosphamide, which is related with its effects of anti-oxidative injury and DNA damage repair. Our recent studies showed that wuziyanzong pills significantly improved the spermatogenic dysfunction of aging, and improved the function of Sertoli cells of aging rats.The related research showed that endoplasmic reticulum stress damage was directly related to Sertoli cells damage and reproductive disorders. Our preliminary experimental results showed that wuziyanzong pills has the effect of regulation on endoplasmic reticulum stress-related proteins, including GRP78 and CHOP, suggesting wuziyanzong pills alleviates endoplasmic reticulum stress injury and improves the Sertoli cell function, thus delaying reproductive decline. In this project, in both a natural aging rats model and Sertoli cells in vitro model, we investigate whether the improvement effects of wuziyanzong pills on the decline of Sertoli cells and reproductive function of aging are related with regulation of endoplasmic reticulum stress by flow cytometry, immunofluorescence, SiRNA technology. These data will clarify the molecule mechanism of wuziyanzong pills on alleviation of male reproductive function with aging and provide a scientific basis for prophylaxis and therapy of testis aging.

因年龄增高导致的睾丸生精功能减退与生育缺陷已成为当前急需解决的生殖健康问题。我们前一个基金项目研究结果显示，五子衍宗丸能显著改善环磷酰胺所致睾丸生精障碍，其机制与抗氧化损伤与促进DNA损伤修复相关；近期研究发现，五子衍宗丸能显著改善衰老大鼠睾丸生精功能，且对Sertoli细胞功能有调节作用。相关研究显示，内质网应激损伤与Sertoli细胞功能、睾丸生精障碍直接相关；预实验结果显示，五子衍宗丸对内质网应激相关蛋白GRP78、 CHOP等有调节作用，提示五子衍宗丸可能通过减轻内质网应激损伤、改善Sertoli细胞功能，从而减缓睾丸生精功能衰退。本项目拟采用自然衰老大鼠与体外培养Sertoli细胞模型相结合，运用流式细胞分析、免疫荧光、SiRNA等技术，从调节内质网应激与Sertoli细胞功能角度，研究五子衍宗丸改善衰老所致睾丸生精功能减退的作用与机制，为临床防治男性生殖障碍提供科学依据。

因年龄增高导致的睾丸生精功能减退与生育缺陷已成为当前临床急需解决的生殖健康问题，但目前仍缺乏有效的防治措施。五子衍宗丸是临床改善男性生殖功能的代表性方剂，但其作用机制仍有待深入研究；我们前期研究发现，五子衍宗丸能显著改善衰老大鼠睾丸生精功能，且其作用机制与调节Sertoli细胞功能密切相关。而相关研究显示，内质网应激损伤与Sertoli细胞功能损伤、睾丸生精障碍直接相关；且我们之前初步实验结果显示，五子衍宗丸对睾丸组织内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP等有调节作用，进而提示五子衍宗丸可能通过减轻内质网应激损伤、改善Sertoli细胞功能，从而减缓衰老睾丸生精功能衰退。基于此，本项目首先以6月龄、12月龄、18月龄、22月龄和24月龄大鼠为研究对象，研究增龄对大鼠睾丸内质网应激和Sertoli细胞功能的影响及机制。研究结果表明，增龄过程中大鼠睾丸和附睾重量及其指数显著降低，精液质量显著下降，睾丸组织形态发生退行性变化，生殖细胞凋亡增加，生精功能逐渐减退，进一步研究表明其生殖功能衰退的机制与激活内质网应激介导的细胞凋亡通路和激活p38MAPK/MMP-9通路介导的Sertoli细胞紧密连接功能衰退有关。随后，我们采用自然衰老大鼠模型研究五子衍宗丸改善衰老睾丸生殖功能减退的作用及分子机制。结果表明，五子衍宗丸可通过调节睾丸内质网应激、抑制Sertoli细胞p38MAPK/MMP-9通路的激活，从而减轻生殖细胞凋亡，改善Sertoli细胞分泌功能和紧密连接功能，进而有效延缓衰老所致的生殖功能衰退。最后，在体外培养的Sertoli细胞模型中，进一步证实了五子衍宗丸有效成分可有效减轻Sertoli细胞内质网应激损伤，并可通过抑制p38MAPK通路改善Sertoli细胞紧密连接功能损伤。综上所述，增龄可导致睾丸组织内质网应激损伤与生殖细胞凋亡增多，Sertoli细胞功能衰退，最终导致生精功能的逐渐衰退；五子衍宗丸可通过提高睾丸组织内支持细胞未折叠蛋白反应，减轻内质网应激介导的细胞凋亡，并改善Sertoli细胞分泌功能和紧密连接功能衰退，进而延缓衰老所致的生精功能衰退。本项目的完成，为临床运用五子衍宗丸防治衰老所致的睾丸生精障碍与男性不育提供实验依据，同时亦有助于进一步阐明五子衍宗丸改善男性生殖功能的分子机制。