橡胶树HbCERK1基因过表达对激发橡胶树PTI免疫反应的影响及抗病转基因橡胶树的产生

The rubber tree (Hevea brasiliensis) is the main source of the natural rubber.Diseases cause 10-30% yield loss annually in China. Improvement of the disease resistance is one of the most effective strategies to ensure the safety in rubber production. It has been reported that the transgenic plants with the genes coding pattern recognition receptors could enhance the PTI (PAMP-triggered immunity) resistance to pathogens. Receptor kinase CERK1 is one of the pattern-recognition receptors (PRRs) for chitin, a pathogen-associated molecular patterns(PAMPs). In this project, we will introduced HbCERK1 into rubber tree by Agrobacterium-mediated transformation. Overexpressed HbCERK1 transgenic rubber tree will be analysed for expression level of target gene, disease resistance to various pathogens as well as agronomic traits comparing with its wildtype to obtain the transgenic plants with appropriate gene　expression, good disease resistance and agronomic traits being similar to the receptor rubber tree variety. Meanwhile, HbCERK1 will be introduce into Arabidopsis cerk1 mutants for functional complementation. Integrated biological and biochemical analyses will be carried out to better understand how HbCERK1 triggerred rubber tree PTI. Implementation of the project will provide a theoretical basis and anti-sources for rubber breeding for disease resistance.

巴西橡胶树是天然橡胶的主要来源，病害导致我国橡胶产量每年损失10-30%，提高其抗病性是确保我国天然橡胶安全生产的有效措施之一。研究表明，植物转入编码识别病原模式受体蛋白的基因后，其病原模式激发免疫PTI增强，抗病性提高。受体激酶CERK1是识别病原菌相关分子模式几丁质的模式识别受体。本项目拟利用已建立的橡胶树再生和遗传转化体系，根癌农杆菌介导，将橡胶树HbCERK1基因转入橡胶树，获得HbCERK1基因过表达转基因橡胶树，并进行目标基因表达水平和抗病性鉴定以及与受体橡胶树品种农艺性状对比，以期得到表达适中、抗病性好且农艺性状相近的转基因植株。同时将HbCERK1转化拟南芥cerk1缺失突变体进行功能互补，分析该基因在模式植物中的功能。综合生物学功能分析及生化功能鉴定,以期深入了解HbCERK1基因对激发橡胶树PTI抗性以提高抗病性的作用和功能。项目实施为橡胶树抗病育种提供理论依据和抗源。

巴西橡胶树是天然橡胶主要来源，病害导致我国橡胶产量损失10-30%，利用基因工程进行抗病育种是我国乃至全球橡胶树研究的重要内容。植物转入编码识别病原模式受体蛋白的基因后，其病原模式激发免疫PTI抗病性增强。受体激酶CERK1是识别病原菌相关分子模式几丁质的模式识别受体。本项目对橡胶树胚性愈伤组织再生和遗传转化体系进行优化，利用优化体系将编码橡胶树CERK1蛋白的HbLYK3（原HbCERK1）、HbLYK1和HbLYK2导入橡胶树以提高抗病性。主要研究结果如下：.1、热研7-33-97橡胶树未开雄花以纵径2.81～3.20 mm、纵横比2.15～2.18、花萼黄绿色时，花粉发育多为单核靠边期，为最佳外植体；单粒花药接种，胚性愈伤组织诱导率提高40.7%，体细胞胚分化率提高80%；以2,4-D、6-BA、Zt和TDZ组合，胚性愈伤组织诱导率提高60.7%，体细胞胚分化率提高167%。.2、花药源子叶形体细胞胚是诱导胚性愈伤组织的优良外植体和胚性愈伤组织高效增殖的优良看护哺育材料，增殖提高2.76倍。.3、添加外源L-谷氨酰胺、Vc和水杨酸是6±2℃低温中短期离体保存胚性愈伤组织的适宜方法。.4、体胚源胚性愈伤组织及其悬浮细胞系是遗传转化的优良受体；.5、以根癌农杆菌EHA105液（OD600=0.2～1.0），侵染10～45 min，添加100 μMAS、22～25℃共培养3 d，250～500 mg·L-1羧苄和30～50 mg·L-1潮霉素进行抗菌筛选优化出两套高效遗传转化体系。.6、获7个转橡胶树HbLYK3转基因橡胶株系；获转HbLYK1、HbLYK2抗性体细胞胚系，经PCR、RT-PCR和Western-blot检测，表明HbLYK1、HbLYK2和HbLYK3已经整合到橡胶树基因组中。.7、获转橡胶树HbLYK1、HbLYK2和HbLYK3拟南芥转基因株系，转基因植株与野生型植株的表型差异不大，其抗病性有待对比分析。.8、橡胶树HbLYK3无几丁质结合活性，而HbLYK1、HbLYK2有几丁质结合活性，且后两者胞内区具激酶活性。.以上结果为后续转橡胶树HbLYK1、HbLYK2和HbLKY3的转基因橡胶树抗病性、激发PTI抗性以提高抗病性的作用和功能的对比分析提供研究材料，为抗病育种提供理论依据、抗源和转化技术。