民族药野棉花防治类风湿关节炎的药效物质与作用机制研究

Etiology of rheumatoid arthritis (RA) is still unknownand it has no satisfactory treatments yet. The ethnodrug Anemone vitifolia has a good effect on RA in folk common using, but its chemical composition and biological activity is unclear. The applicant's previous study showed that the extract and 70% ethanol fractions from macroporous resin has significantly anti-inflammatory and analgesic effect and it could reduce ankle swelling on the rat model of AA effectively and then inhibit the pathological process. Therefore, this project intends to adopt an animal model of AA in rats for the screening of the effective parts of A. vitifolia, to determine the active site and separate the ingredients. On this basis, according to the in vivo activity tests, to obtain the ingredient (base) which has the relatively large contribution rate on the activity and can represent the main effect of the effective parts by using the technology of "target component knock-out/ knock-in". In vitro anti-inflammatory activity rescreening and detection of cytokines (TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-2，IL-6，IL-8，IL-17，CXCL10 and CCL19) from serum and synovial cells of rats was performed to explore the mechanism of its anti-RA. The implementation of this project and its active substances' elaboration will surely be beneficial to enrich and expand the medicinal value of A. vitifolia, and it has important theoretical significance on its in-depth research and utilization, and promote economic development in the region, etc.

类风湿性关节炎（RA）病因不明，至今尚无理想的治疗药物。野棉花在民间常用于风湿痹痛，疗效确切，但其活性成分和作用机制尚不明确。本课题前期研究表明，野棉花提取物具有明显的抗炎镇痛活性且能有效抑制大鼠类风湿性关节炎的病理进程。本课题拟采用佐剂性关节炎大鼠动物模型,对野棉花抗RA的有效部位进行筛选并阐明其化学成分。在此基础上，利用"目标成分敲出/敲入技术"，并结合体内、外活性筛选结果，进一步获取其活性贡献率相对较大、能代表其主要功效的活性成分（群）。利用酶联免疫法、逆转录聚合酶链反应等方法对大鼠血清及滑膜细胞相关细胞因子TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-2，IL-6，IL-8，IL-17，CXCL10和CCL19的检测分析进而对野棉花抗RA的作用机制进行探讨。本研究对野棉花抗RA活性物质的发现，丰富和拓展了野棉花的药用价值，对其深入研究与综合利用、促进地区经济发展等方面均具有重要意义。

本项目总结了银莲花植物分类、资源分布、化学及药理等研究进展，调查了野棉花药材资源，并采集野棉花药材，进行提取和萃取、获得不同极性部位；基于大鼠完全弗氏佐剂诱导的类风湿性关节炎动物模型（AA模型）和LPS诱导的BV-2炎症细胞模型，对不同极性部位进行体内外活性筛选，明确野棉花正丁醇萃取部位和乙酸乙酯部位为其主要活性部位。通过色谱学和光谱学相结合的研究手段，从活性部位共分离鉴定57个单体化合物，其中54个化合物首次从该物种分得，有19个化合物首次从银莲花属中分得。化学成分研究表明，野棉花的活性部位的主要成为三萜皂苷类成分，通过AA大鼠模型以及BV-2炎症细胞模型对其总皂苷的活性测试以及单体化合物的抗炎活性测试，结果表明，野棉花的总皂苷呈现出微弱的抗炎作用，且从野棉花中分得的单体化合物抗炎活性不明显，只有在较高剂量（130~210 µM）才呈现一定的抗炎活性。因此，为了进一步阐释野棉花药材的药用价值，结合其传统用药，本项目又开展了野棉花药材抗肿瘤以及神经保护的研究，研究发现，部分三萜类化合物呈现显著的抗肿瘤作用和一定的神经保护作用：正丁醇层分得的化合物1-4具有显著的细胞毒活性，其IC50值在2.5~12.0μM之间，化合物1-4能显著诱导HepG2细胞的凋亡；作用机制研究结果表明，化合物1和2可以调节bax/bcl-2的表达，促进caspase-3和caspase-9的蛋白表达；乙酸乙酯层分得的化合物21，14和19能够显著抑制HepG2细胞的生长的作用；采用谷氨酸诱导的PC12细胞损伤模型进行化合物神经保护作用的活性筛选，实验结果显示：正丁醇层分得的化合物23在40, 80μM时呈现一定神经保护作用。综上，本项目研究提示，野棉花药材药用价值表现为多方面，而其抗RA作用是否与抗肿瘤作用有相关性，值得进一步深入探讨。项目发表期刊论文3篇，会议论文1篇，培养硕士研究生2名，培养青年教师1名。