硫氧还蛋白介导的巯基/二硫键转换对植物抗逆代谢的调节

植物的干旱抵御是"系统"工程，需多个基因/蛋白协同作用。除纵向的转录因子调节外，横向地同时控制多个基因/蛋白性质使其整体提高对干旱胁迫适应能力的研究尚无头绪。我们前期研究发现，在沙漠中生活的芦苇- - 沙丘芦苇中存在未知的蛋白质调节机制。这种机制致使原本的亲水性蛋白质具有疏水性。这种大规模的蛋白质"亲/疏水性调节"可能为揭示植物干旱应答网络多基因/蛋白的同时调控提供研究线索。这个线索处于植物干旱应答网络的各级"终端"。我们强烈地注意到：具有亲/疏水转换能力的蛋白质均为硫氧还蛋白的靶标分子，暗示蛋白质"巯基/二硫键转换"的重要角色。本课题用比较蛋白质组学、分子生物学和蛋白质化学技术，利用多种荧光标记物研究1）具有亲/疏水转换能力的蛋白质；2）具巯基/二硫键的蛋白质；3）硫氧还蛋白的角色，以深入解析沙丘芦苇这种蛋白质调节机制。蛋白质的疏基/二硫键转换很可能是一个尚未破解的表征植物抗旱调控的信号元件

芦苇（Phragmites communis）是常见水生植物，分布于世界各地。前期研究发现：芦苇的沙漠生态型（沙丘芦苇）具有未知的蛋白质调节机制，致使亲水性蛋白质具有疏水性。这种大规模的蛋白质"亲/疏水性调节"可能是野生植物应对“复合逆境”的策略。其作用可能是保护蛋白质和细胞膜。本课题用比较蛋白质组学和分子生物学方法解析这些发生亲/疏水转换的蛋白质、具有巯基/二硫键的蛋白质以及硫氧还蛋白的角色。.我们发现，沙丘芦苇（DR）和沼泽芦苇（SR）相比，细胞总蛋白含量相近或稍低；但可溶性蛋白和难溶性蛋白的比例变化较大。在DR细胞中，只有28.6%的蛋白质是可溶性的，高达71.4%的蛋白属难溶性蛋白。这说明DR中许多蛋白质发生了“膜向移动”反应。通过2D-DIGE分析，DR中有93个蛋白点的移动率超过25%。各类质谱已鉴定出80%的膜向移动蛋白。其中大部分是叶绿体蛋白，可归于39个种类。这39种蛋白质主要涉及光合作用、转运ATP酶、蛋白质合成、蛋白折叠与稳定，以及防御反应。膜向移动丰度最高的蛋白质是Rubisco，其大、小亚基分别移动52.8%和52.3%；其次是Rubisco的激活酶（RCA）、多种叶绿体分子伴侣，包括60kDa，70kDa, 90kD蛋白以及2-Cys Prx。以Rubisco为例，我们研究了蛋白膜向移动的机制。测序分析排除了蛋白初级结构的因素。我们认为蛋白质的二硫键化引发的构象变化是这种膜向移动反应的原因之一。在还原剂存在条件下，DR细胞的可溶性蛋白、Rubisco的酶量及活性均显著增加。这表明膜向移动反应是可逆的，且受细胞氧化还原状态调节。采用PCMB滴定法和活化的巯基琼脂糖凝胶层析，均发现SR中存在大量还原性巯基（-SH），而DR中存在大量二硫键（-S-S-）。RNA-seq分析发现PDI蛋白家族可能是DR蛋白二硫键形成的重要酶类。采用亲和层析加非标记质谱技术、饱和荧光差异凝胶电泳技术，我们已鉴定了含二硫键的蛋白质。转录组分析已获得包括TRX在内的多种与氧化还原相关基因的表达。在评估各类氧化还原指标后，我们确认DR细胞处于相对氧化状态。细胞中的活性氧有所累积，但细胞膜依然稳定。因此我们认为蛋白质的“膜向移动反应”对沙丘芦苇的蛋白和膜保护至关重要。本项目首次在沙漠植物中发现大量蛋白质的“膜向移动反应”。为植物对真实生境的耐逆性研究拓展出新的方向。