衰老相关蛋白调控蚤状溞生殖模式的机制研究

Combining the basis of previous research, and synthesizing transcriptome, cell biology, molecular biology and immunohistochemical methods and techniques, the miRNA expression profiling and gene expression profiles of different generations in Daphnia pulex, live in fresh waters, are constructed by transcriptional genome sequencing; The miRNA expression profiling and gene expression profiles are analyzed comparatively by use of bioinformatics, and miRNA and target genes interrelated in sequence and expression pattern are screened; The cDNA of differential expression genes are cloned by the RT-PCR and rapid amplification of cDNA ends (RACE); Expression and location of miRNA and target genes are analyzed by Real-time PCR、Western Blotting, whole-mount in situ hybridization and whole-mount in situ immunohistochemistry; Then using RNA interference technique to suppress miRNA expression and detecting changes of target genes at spatial and temporal expression, and verify the regulating effect of miRNA to target genes. Combined with morphological phenotypic indicators of aging-related ulteriorly, analyze regulation of miRNA in the corresponding signal pathway of D. pulex in the aging process. We aim is to explore the variation and molecular basis of cladocerans reproductive patterns, build technology platform of miRNA function analysis (identification and functional identification of target genes), provides a theoretical basis for molecular mechanisms of regulating switch reproductive transformation of cladocerans.

本项目以淡水水域常见种蚤状溞为研究对象，拟通过转录组测序构建蚤状溞miRNA表达谱和蚤状溞不同世代的基因表达谱；利用生物信息学手段对miRNA表达谱和基因表达谱进行比较分析，筛选出在序列和表达模式上相互关联的miRNA和靶基因；克隆差异表达基因获得其cDNA全长；对相互关联的miRNA和靶基因，利用Real-time PCR、Western Blotting和整体原位杂交技术、整体原位免疫组化方法进一步定量和定位分析；采用RNA干扰技术，对蚤状溞体内的miRNA进行沉默，检测蚤状溞体内与所沉默miRNA相关联基因的表达水平，验证miRNA对相应基因的调控作用，并结合与衰老相关的形态学表型指标变化，深入分析miRNA在蚤状溞衰老过程中对相应信号通路的调控作用。本研究旨在探索枝角类生殖模式的变化规律和分子基础，搭建枝角类miRNA功能解析技术平台，为实现枝角类生殖转化的人为调控奠定基础。

本项目综合转录组学、细胞生物学、分子生物学及免疫组化等学科的方法和技术，以淡水水域常见种蚤状溞（Daphnia pulex）为研究对象，（一）通过转录组测序构建了蚤状溞miRNA表达谱和蚤状溞不同日龄的基因表达谱；利用生物信息学手段对miRNA表达谱和基因表达谱进行了比较分析，筛选出多个与生长、衰老和生殖相关的基因，筛选出在序列和表达模式上相互关联的miRNA和靶基因。（二）借助RACE-PCR技术获得重要差异基因phb1、phb2、caspase-3、sir2、jnk、akt、CAT、S6K、Cp、FoxO和Chit的cDNA全长；（三）利用Real-Time PCR技术、Western blot技术和整体原位杂交技术、免疫组化方法进一步定量和定位分析了上述筛基因在蚤状溞不同日龄状态下的表达水平；（四）通过RNA干扰技术对部分衰老相关基因phb1、S6k和生殖相关基因dsx、tra在蚤状溞生长生殖过程中的功能进行了分析。并从PI3K/Akt等信号通路角度分析了干扰phb1和S6K基因后对性别、衰老相关基因（AKT，4EBP，S6，Dsx和Tra）表达的影响；（五）结合蚤状溞衰老相关表型指标的建立及部分生化指标测定，为探索枝角类的衰老机理提供更多的思考；（六）首次运用双荧光素酶报告基因技术探明miRNA-2885，miRNA-6960-5p，miRNA-7023-5p对基因S6K具有显著的调控作用；（七）克隆了蚤状溞自噬相关基因p8和蛋白ATG5和ATG8，对蚤状溞不同生殖方式不同发育时段的自噬水平做了分析，推测p8对自噬有一定的调控作用从而影响蚤状溞休眠卵的产生；（八）蚤状溞衰老的蛋白质组学分析，利用iTRAQ与2D LC-MS/MS蛋白质组学分析相结合的技术，筛选衰老阶段差异表达的蛋白及分析蛋白的动态变化；（九）从生物钟对蚤状溞衰老的影响，更深层次的了解蚤状溞衰老的机理及与两种生殖方式之间的关系。. 本研究旨在搭建枝角类miRNA功能解析技术平台（靶基因的识别和功能鉴定），从衰老角度探索枝角类生殖模式的变化规律，为后续枝角类生殖转换的研究提供理论基础。