光敏定位成像在致密核心囊泡分泌机制和结构研究中的应用

囊泡的转运和与细胞膜的融合是细胞内重要的物流系统，具有重要的生理意义。致密核心囊泡（DCVs）储存内分泌激素，并通过将激素释放到血液中实现对一系列生理过程的调控。超分辨光学显微成像技术的发展使得对象DCVs这样小于200nm的细胞器进行分子水平的结构观察和分析成为可能，本项目利用光敏定位显微成像来研究：（1）DCVs锚定、启动等几个分泌前状态下分泌调控蛋白在分子水平的定位差异，为目前分泌理论提供新的依据，并将根据发现对现有理论进行修正；（2）得到致密核心区域的结构细节以及分泌前后此区域的分子水平的变化。

按项目计划，我们首先进一步发展了光敏定位成像技术，经过筛选了定位精度更高（20 nm）的绿色荧光蛋白mGeosF；进而，通过mGeosF，PATagRFP等光转换荧光蛋白标记DCV结构蛋白及囊泡分泌相关蛋白，使用单色或多色PALM超分辨显微成像技术进行荧光成像，探索INS-1细胞中致密核心大囊泡的组成和分泌机制。我们研究了DCV的致密核心区的组成蛋白—Insulin，DCV的膜蛋白—VAMP2以及位于细胞膜上的t-SNARE蛋白—SNAP-25等蛋白在细胞膜附近~200 nm范围内的分布及定位，发现：Insulin和VAMP2集中分布在直径大约为200 nm的区域内，而SNAP-25则在细胞膜附近呈弥散分布。利用双色PALM实验，我们研究了DCV结构相关蛋白（VAMP2，NPY，Insulin，PLM-1，PC2）和DCV分泌相关蛋白（SNAP-25，Munc-18）的二维分布及定位关系。