一氧化氮介导的桦褐孔菌多酚生物合成调控机理研究

野生桦褐孔菌可产生极具药用价值的硬毛素类多酚(多酚),但生长速度极为缓慢。人工培养可使该菌生长加快,但多酚含量极低。这是由于NO对苯丙氨酸解氨酶(PAL)亚硝基化修饰(SNO-PAL)限制了多酚过量合成。硫氧还蛋白(Trx)和硫氧还蛋白还原酶(TrxR)仅在亚硝基谷胺酰胺还原酶(GSNOR)受抑制时才能去亚硝基化并使多酚积累增加。但NO与PAL结合位点、GSNOR及Trx/TrxR活性与多酚积累和组成关系、去亚硝基化的必要条件以及GSNOR制约Trx去亚硝基化的分子机制均不清楚。本课题拟用酶抑制剂研究GSNOR和Trx/TrxR活性与多酚积累和组成关系；用原核表达的上述活性蛋白研究PAL亚硝基化修饰位点、Trx/TrxR去亚硝基化分子机制及GSNOR制约Trx/TrxR去亚硝基化的作用机理。研究结果将揭示NO介导的桦褐孔菌多酚生物合成调控机理，为真菌次生代谢产物合成调控研究提供有价的参考。

菌桦褐孔菌是产生硬毛素类多酚的药用真菌，实验室培养可生长快速，但很少积累硬毛素多酚。一氧化氮（NO）可提高硬毛素多酚积累，但高水平NO导致细胞蛋白亚硝基化，并且与细胞硫氧还蛋白(Trx system)以及亚硝基谷胱甘肽还原酶系统 (GSNOR system)的酶活性密切相关。然而，NO调控硬毛素合成、Trx 和GSNOR 系统调控硬毛素合成酶氧化还原状态的作用机制尚不清楚。本项目以真菌混合培养为内源性NO诱导手段，系统研究NO诱导的一系列生物学事件，包括NO信号传导途径、蛋白质翻译后亚硝基化修饰、Trx 和GSNOR对NO信号传导的调节以及对硬毛素多酚合成及产物组成的影响，获得以下科学发现：1) 桦褐孔菌编码组成性NO (cNOSL)和诱导性NO合成酶(iNOSL)类似蛋白。其中，编码cNOSL 基因表达水平恒定，为细胞正常生长发育所必须；编码iNOSL 基因表达水平在真菌共培养体系中显著增加。2) NO经可溶性鸟苷环化酶(sGC)途径刺激真菌苯丙素代谢途径表达，促进硬毛素多酚的积累。3) NO水平快速提升还引起硬毛素合成酶的可逆性亚硝基化，从而制约硬毛素多酚积累水平的进一步提升。4) Trx和GSNOR系统对蛋白亚硝基化修饰水平具有关键的调控作用。抑制TrxR和GSNOR分别导致蛋白亚硝基化水平提升和下降，从而调节硬毛素合成酶活性的下降或上升。 5) 桦褐孔菌编码3个硫氧还蛋白(TrxL), 其中，TrxL1和TrxL3分别在40位和60位有一个非催化性Cys。TrxL1和TrxL3与TrxR组成的Trx系统通过形成二硫键混合二聚体去亚硝基化。TrxL2无非催化位点Cys，以转移NO的机制去亚硝基化。6) TrxL1和TrxL3非催化位点Cys亚硝基化可显著增加Trx系统去亚硝基化活性，加速重新活化亚硝基化的硬毛素合成酶。7) GSNOR与TrxL1和TrxL3的相互作用，可释放TrxL1或TrxL3非催化位点CysNO的NO，从而下调了Trx系统的去亚硝基化活性。本项目阐明了NO信号传导的双重性，即促进防御基因表达和次级代谢产物形成；通过蛋白亚硝基化修饰，防止碳氮源过度用于次级代谢产物的合成。项目成果首次揭示了硬毛素多真菌酚合成调控的分子机制，为高产硬毛素多酚的桦褐孔菌菌株构建奠定了理论和实验基础，对其他真菌代谢产物合成调控也有参考意义。