蛋白琥珀酰新修饰的调控网络及其调控酶特异性底物的系统分析和功能研究

The aim of this project is systematic characterization of lysine succinylation (Ksucc) pathway and regulatory cellular networks using mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics, antibody-based technology, biochemistry, and bioinformatics approaches. The first specific aim of this project is to systematically investigate the Ksucc substrates in cell lines of five species (Escherichia coli, yeast, fruit fly, mouse and the human cells) by affinity purification (AP) and MS approach. Based on the proteomics data, we will futher illustrate the evolutionary dynamics and core regulatory networks of lysine succinylome from bacteria to higher animal species. The second specific aim of this project is to globally profile the specific Ksucc substrates regulated by Sirt5, the first identified lysine desuccinylase. We will systematically quantify the change of lysine succinylation level in the wide type and SIRT5-/- cell lines using SILAC (stable isotope labeling by/with amino acids in cell) based MS approach to characterize the SIRT5-targeted substrate candidates and regulatory cellular pathways. We will further use antibody, biochemistry and molecular biology approaches to validate and explore the possible biological function of SIRT5 involved lysine succinylation pathways. This project will provide the first global picture of lysine succinylation substrates and cellular networks from bacteria to mammals, and the SIRT 5 regulated cellular pathways of lysine succinylation, providing a step stone for understanding the biological functions of lysine succinylation pathway.

本项目旨在利用基于质谱的定量蛋白质组学技术、泛修饰抗体技术、生物化学、生物信息学等手段，系统性研究不同物种细胞及受SIRT5调控的赖氨酸琥珀酰新型修饰通路底物和调控网络。通过赖氨酸琥珀酰修饰泛抗体亲和富集、结合质谱分析，来系统性研究大肠杆菌、酵母、果蝇、小鼠以及人等五种不同物种赖氨酸琥珀酰谱的分布情况，比较该新修饰通路在物种进化中的蛋白质组动态演变过程，阐述在物种进化过程中琥珀酰修饰核心细胞通路和调控网络。进一步地，利用细胞培养条件下稳定同位素标记技术（SILAC），结合抗体和质谱技术，系统性定量比较SIRT5缺陷细胞与野生型细胞中底物琥珀酰修饰化水平的变化， 来鉴定SIRT5调控的特异性底物和调控网络，并对相关生物学功能进行进一步验证和探索。由此系统性阐述琥珀酰新修饰通路和其调控酶SIRT5的底物、调控网络和分子作用机理，为深入认知该修饰通路的生物学功能、及相关疾病机制奠定基础。

本项目旨在利用基于质谱的定量蛋白质组学技术、泛修饰抗体技术、生物化学、生物信息学等手段，系统性研究不同物种细胞（包括大肠杆菌、酵母、果蝇、小鼠、人等）及受SIRT5调控的赖氨酸琥珀酰新型修饰通路底物和调控网络，并系统性比较该修饰通路在物种进化中的动态演变过程。由于在项目执行过程中，国际上已有与本项目研究方案相似的文章报道，因此项目在按照项目设计进行赖氨酸琥珀酰化修饰研究之外，我们进一步对项目研究内容进行了拓展，即利用琥珀酰化修饰的技术手段和策略深入研究原核生物和真核生物体内的乙酰化、丙二酰化、甲基化修饰谱等，利用生物信息学，全面系统分析各修饰类型参与调控的网络及功能分子机制等。在项目执行过程中，我们取得了一系列进展，包括：1）我们在国际上首次对原核生物大肠杆菌的琥珀酰修饰谱、赖氨酸丙二酰化修饰以及金黄色葡萄球菌的乙酰化修饰谱进行了系统的蛋白质组学研究，并发现了CobB为琥珀酰修饰的调节酶；2）通过运用修饰抗体、生物质谱和生物化学等方法，发现了细胞中一种新的蛋白翻译后修饰—赖氨酸戊二酰化。通过运用有机合成、色谱和质谱分析、体内稳定同位素标记等方法，证实了此修饰在生物体内的存在，提示戊二酰辅酶A可能为此修饰供体。3）建立了赖氨酸丙二酰化修饰肽段富集平台，并对SIRT5调控的蛋白底物进行了大规模蛋白质组学研究；4）建立了基于蛋白丙酰化、免疫共沉淀富集和高分辨率质谱的新型赖氨酸单甲基化修饰的化学蛋白质组学新方法，为研究细胞及疾病样本中的甲基化修饰提供了强有力的技术支持。5）对高糖诱导的糖尿病小鼠组蛋白修饰谱进行系统性的研究分析，鉴定和定量分析到了高糖诱导的糖尿病小鼠肝脏组蛋白的6个显著性差异位点。本项目最终系统性揭示了多种赖氨酸酰化新修饰的底物，发现了赖氨酸酰化新修饰的调控酶，建立了赖氨酸修饰系统鉴定的新方法，阐述了赖氨酸修饰的相关生物学和病理学的潜在新功能，为赖氨酸翻译后修饰的深入生物学功能和相关疾病病理机制研究提供重要资源和参考。