长期施化肥土壤中微生物进化的研究

The elements nitrogen and phosphorus are important nutrients for the growth of crops. The chemical manures supply enough nitrogen and phosphorus sources to enhance the crop production in China, and supply too much inorganic nitrogen and phosphorus that the most preferable nitrogen and phosphorus sources for the growth and living of microorganisms in soil. High concentration of inorganic nitrogen and phosphorus in soil inhibit the conversion of organic nitrogen and phosphorus to inorganic nitrogen and phosphorus, and inhibit the expression and regulation of enzymatic genes for organic nitrogen and phosphorus metabolism and mineralization by microorganisms in the soil. The long time spreading of chemical manure to soil will be a environmental selection stress that leading to the decreasement of organic nitrogen and phosphorus metabolic abilities of microorganisms in the soil. The essences of decreasement are the deficiency of functional genes and genomic evolution of microorganisms. In this research project, we will take the microorganisms in farming soil as the research object. The important microorganism groups in the soil will be found out by microbial ecology studies, and emplolied as objective strains for the subculturing experiment in the laboratory. In subculturing experiments, we will study the changes of functional gene copy, activity and structure of objective strains in the whole subculturing process. After the deficiencies are detected, the genomes of functional gene deficient strain and initial strain will be sequenced. The genomic evolution of microorganisms under selection stress are studied on the genome levels by comparing the deficient strains with the initial strains. This project are helpful for revealing the influence of long time chemical manure spreading on the microbial genomic evolution and its mechanisms. The findings are meaningful for analyzing the destroyment of long time chemical manure spreading to farming soil, and guiding the bioremidation of the destroyed farming soil.

氮和磷是农作物生长发育过程中必需的大量元素，化肥的大量施用为农作物的生长提供了充足的氮磷，也为土壤中微生物的生命活动提供了大量的无机态氮磷。土壤中高浓度的无机氮磷抑制了有机氮磷的转化，也抑制了微生物有机氮磷降解和矿化作用酶基因的表达调控；长期的施肥作为环境的一种选择压力，必然导致微生物有机氮磷代谢功能的退化，表现为功能基因缺失和基因组的进化。本项目以耕地土壤微生物为研究对象，通过微生物生态学的研究确定土壤中重要的微生物种类；以重要微生物为对象进行实验室模拟传代，研究传代过程中菌株功能基因拷贝、活性和结构的变化规律；功能基因发生缺失后，对传代前后的菌株进行全基因组序列的测定，在基因组水平上比较分析初始菌株与传代菌株基因结构，研究选择压力存在下微生物基因组的进化。本项目有利于揭示长期施化肥对土壤微生物基因组进化的影响和作用机理，对分析长期施肥对耕地土壤生态的破坏，指导土壤生态修复有重要意义。

长期而不合理的化肥施用不可避免的导致农田土壤生态的破坏，特别是对土壤微生物功能和结构的破坏。土壤中高浓度的无机磷抑制了有机磷的转化，也抑制了微生物有机磷降解基因的表达调控，长期的施肥作为环境的一种选择压力，必然导致微生物有机磷代谢功能的退化，表现为功能基因缺失和基因组的进化。为了研究长期施用化肥对土壤微生物进化的影响，本项目研究了不同农田土壤中细菌碱性磷酸酶基因phoX和phoD的多样性，以此为根据从代表性土壤中筛选了具有较高碱性磷酸酶活性的细菌菌株，通过基因组和转录组分析研究了该菌株利用不同磷源时基因的功能，并利用实验室传代模拟了无机磷肥作为选择压力时的细菌基因组进化。本项目目前得到的主要结果包括：1）细菌phoD基因主要分布于土壤uncultured bacteria和Proteobacteria门，phoX基因分布于Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Actinobacteria和Chloreoflexi；2）分离的有机磷降解菌株分别与Bacillus、Acinetobacter和Arthrobacter有较高同源性，有机磷存在时表现了较高的碱性磷酸酶活性；3）对菌株Acinetobacter sp. GN1进行了全基因组测序，发现它的PhoD序列与已知的序列相似性较低；4）比较转录组研究发现，以有机磷为磷源时，碱性磷酸酶基因phoA、phoB和phoD，以及磷酸盐运载蛋白PstA、PstB、PstC和PstS基因的表达量均显著上调；5）以菌株Acinetobacter sp. GN1为对象进行了实验室传代，450d的连续传不但没有降低反而促进了其碱性磷酸酶活性；6）对传代后的GN1全基因组进行了重测序，共检测到98个SNP、157个SV和23个基因拷贝数变化，但这些均与磷代谢无关。由于实验室传代时间还较短，尽管菌株GN1的基因组结构有了较大的变化，但无论细胞水平或基因（组）水平仍未出现预期的变化，因此暂未得出细菌基因组在长期选择压力下进化的分子机制。本项目的实验室传代将继续下去，期望通过更长时间的模拟进化，探索土壤微生物退化与长期施用化肥之间的联系。