miR-100与转录因子p53协调控制基因表达研究

miRNA经典的作用模式是在细胞质中结合靶基因的3'-UTR区，近期有极少数研究表明，启动子区也可以作为miRNA的调控靶点，但miRNA与转录因子的功能关联关系却尚未揭示。我们近期的研究发现，在肝癌发生过程中具有抑癌功能的miRNA-100可以直接作用于重要周期调控分子p21的启动子区，且与转录因子p53竞争结合此区域。本项目拟在此基础上，深入研究miR-100对p53不同靶基因的调控效应的特异性，探讨miR-100与p53之间的相互竞争关系对细胞增殖等的调控作用，揭示miR-100对p21的调控在肝癌发生、发展中的地位，同时探索miRNA分子与转录因子竞争靶基因结合位点的这种"miRNA-转录因子"的拮抗关系在基因表达调控中的普适性及生理学意义。项目有望揭示一类全新的miRNA调控靶基因表达的作用模式，揭示miRNA在细胞核内新的功能意义。

已有研究表明，数百个microRNA的定位于细胞核，然而这些定位于细胞核中的miRNA，在核内的功能目前还不清楚。本研究中，我们使用p21，HDM2，AP1等启动子报告基因系统发现miR-100可以特异下调p21基因启动子的转录活性。p21是细胞周期的关​​键调节分子，还是转录因子p53的重要下游靶基因。我们的研究表明p21的mRNA和蛋白的表达均​​受miR-100抑制。进一步构建了p21启动子区的截短体和突变体，发现miR-100在p21启动子区的结合位点为-1525〜-1535区域，与p53结合位点重叠，在野生型和敲除型p53的HCT116细胞中的实验表明，miR-100的抑制作用依赖于P53。随后通过ChIP和EMSA实验发现miR-100可能干扰p53结合到p21基因的启动子区。有趣的是，我们通过RNA IP实验表明miR-100可与p53蛋白直接结合。进一步定量RT-PCR结果显示，p53的一些靶基因也受到miR-100过表达的抑制。这些结果有可能表明一种新的miRNA调节机制，miR-100可以与转录因子P53竞争性结合P21启动子区，从而抑制P21的对p53转录激活的响应。揭示了肿瘤相关miR-100可能在核内发挥不同于抑制靶基因的功能。miRNA、转录因子TF均是参与生物体基因表达调控的重要因子，我们的研究发现miRNA可以与转录因子结合，通过调控转录因子与其靶基因启动子的结合，从而间接调控更多基因的表达。这种新的相互调控关系将为研究miRNA及整个基因表达调控事件提供新内容。而这些研究也将可能为理解相关疾病的发病机制和治疗药物的研发提供重要的理论支撑和实验依据。