重建RA免疫耐受：TRAF6调控CIA大鼠骨髓来源iDC成熟的研究

Dendritic cells through the activation, induced initial T cell and become the central link to adjust immune response and the immune tolerance. IDC activation into mDC can stimulate lymphocyte proliferation, secrete proinflammatory cytokines. Therefore, inhibiting iDC cell activation will achieve the purpose of alleviating RA. TLR is the key signal of activating iDC in vivo, blocking TLR can influence the activation of the iDC. In the previous study, we found that TRAF6 is the key receptor protein in TLR pathway. Therefore, we put forward assumption: TRAF6 may be the key signal molecules activating iDC，it may play the "main switch" effect in the regulation of iDC mature. To prove this hypothesis, we will develop a rats type II collagen-induced arthritis model, induce and cultivate marrow-derived DC in vitro . The surface mark of the DC is detected by flow cytometry and the secretion of IL-12 is measured by ELISA;The levels of TRAF6 protein in DC and the expression of the mRNA are respectively detected by Western blotting and RT-PCR ; Through RNAi technology , we research that silence TRAF6 gene expression whether can inhibite of the iDC activation, prove that TRAF6 as "molecular switch" inhibiting the mature of iDC and reconstructing RA immune tolerance,and seek new therapeutic targets.

树突细胞通过激活、诱导初始T细胞而成为调节免疫反应和免疫耐受的中心环节。iDC活化转变为mDC可刺激淋巴细胞增殖，分泌炎性因子。因此，抑制iDC细胞的活化可达到缓解RA的目的。TLR是体内活化iDC的关键信号，阻断TLR可抑制iDC的活化。在前期研究中，我们发现TRAF6是TLR通路中的关键接头分子。因此，我们提出假设：TRAF6可能是体内活化iDC的关键信号分子，其在调控iDC成熟中可发挥"总开关"作用。为证实这一假说, 我们拟建立胶原诱导性关节炎大鼠模型、体外诱导培养骨髓来源DCs，以流式细胞术和ELISA检测DCs的表面标志与IL-12分泌;Western blotting 和RT-PCR法检测DCs的TRAF6蛋白水平及mRNA的表达；RNAi技术研究沉默TRAF6基因表达是否能抑制iDC活化，证实TRAF6作为"分子开关"抑制iDC成熟而重建RA免疫耐受，为RA寻求新的治疗靶点。

树突细胞通过激活、诱导初始 T 细胞而成为调节免疫反应和免疫耐受的中心环节。iDC 活化转变为 mDC 可刺激淋巴细胞增殖，分泌炎性因子。TLR 是体内活化 iDC 的关键信号，阻断 TLR 可抑制 iDC 的活化。而TRAF6 是 TLR 通路中的关键接头分子。故此，本项目拟证实TRAF6 可能是体内活化 iDC 的关键信号分子，其在调控 iDC 成熟中可发挥“总开关”作用。在本研究中我们建立胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠模型，从小鼠股骨中提取骨髓细胞。重组小鼠rmGM-CSF、重组rmIL-4诱导CIA小鼠骨髓细胞定向分化为未成熟DCs。用流式细胞仪检测细胞表面CD80、CD86、MHC-II分子证明DC处于不同成熟程度；ELISA检测DC不同成熟状态下IL-12的表达情况；RT-PCR、Western-blot检测各组DC中TRAF6的mRNA以及蛋白的表达情况。将未成熟DCs分为针对TRAF6的小干扰RNA 转染组、阴性 siRNA 转染组和未转染组。转染后行实时荧光定量 PCR 检测 TRAF6 基因表达。脂多糖刺激siRNA转染后的未成熟DCs成熟，流式细胞术检测DCs成熟程度，酶联免疫吸附试验检测DCs释放的促炎症性因子。实验结果得出CIA小鼠造模成功率达84%。不同分化成熟状态下DC表面共刺激分子的表达量逐渐增加；IL-12、mRNA-TRAF6、Protein-TRAF6的表达量与DC的成熟程度呈正相关。转染TRAF6-siRNA组未成熟DCs TRAF6 mRNA表达明显低于阴性siRNA转染组和未转染组，CD80、CD86和MHC-Ⅱ表达明显低于阴性siRNA 转染组和未转染组，IL-12 和 TNF-α 表达明显低于阴性siRNA转染组和转染组。实验结果证明TRAF6 因子在未成熟 DCs 中表达可抑制 DCs成熟和促炎症因子的释放，TRAF6在类风湿关节炎免疫耐受中起到重要作用，为日后RA的靶向治疗提供一种理论依据。