大鼠牙发育过程中caveolin-1、CD147、MMP-2的时空表达研究

Transmission electron microscopy、antisenseoligodeoxynueleotide(ODN) strategy、In situ Hybridization Histochemistry、Real-time PCR and RNA interference are used in this study ,to explore the role of Caveolae/Caveolin-1 in the development of mouse tooth germ.The spatio-temporal expression and implication of Caveolin-1 、CD147 and MMP-2 are examed,to provide the experimental evidences for further research on the role of Caveolae/Caveolin-1 in the development of mouse tooth germ.

以不同胎龄的和出生后1 天的大鼠牙胚组织为实验对象，采用透射电镜、反义核酸技术、原位杂交、Real-time PCR 、RNA干扰技术等观察牙胚细胞中胞膜小窝的形态变化；研究Caveolae/Caveolin-1在牙胚发育中的作用，探讨小窝蛋白-1（Caveolin-1）mRNA、细胞外基质金属蛋白酶诱导物（CD147）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）在牙胚发育过程中的时空表达模式及关联性；以及牙胚发育过程中Caveolin-1调节CD147的功能进而影响MMP-2产生的机制，以期为深入研究Caveolin-1在牙胚发育过程中的作用提供实验基础。

背景：胞膜窖是细胞膜表面特异性内陷微区，提供了细胞信号转导的平台，其标记蛋白窖蛋白-1（Caveolin-1）处于该平台的中心位置，能够募集多种信号分子至胞膜窖，并调节它们的活性，包括CD147。CD147为单次跨膜糖蛋白,胞外2个免疫球蛋白区分别具有激活基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)和结合窖蛋白-1的活性。目的：观察牙胚上皮细胞Caveolae的形态学变化；研究Caveolin-1、CD147和MMP-2在小鼠牙胚发育过程中的时空表达模式并探讨三者之间的调控关系。方法：透射电镜和免疫电镜观察牙胚细胞胞膜窖的形态；免疫组织化学、实时定量荧光PCR检测Caveolin-1、CD147和MMP-2在小鼠牙胚发育中的时空表达模式；在体外培养的小鼠成釉细胞中，细胞免疫荧光技术检测Caveolin-1、CD147和MMP-2蛋白的表达； siRNA技术封闭Caveolin-1的表达后，RT-PCR和免疫印迹试验分别检测Caveolin-1、CD147和MMP-2在转录水平和蛋白水平的表达情况，探讨三者在成釉细胞中的调控关系。结果：在各个发育阶段的成釉细胞细胞膜上均可见形态类似于胞膜窖的凹陷状结构及Caveolin-1免疫阳性颗粒，在发育成熟的成釉细胞的内质网腔中也可见Caveolin-1免疫阳性颗粒。Caveolin-1、CD147自蕾状期开始表达于牙上皮和致密间充质，随着牙胚的发育Caveolin-1表达于成釉细胞，CD147和MMP-2表达于成釉细胞及成牙本质细胞。RT-PCR结果显示相比于E14.5、E16.5和 E18.5时期，PN2时期的牙胚组织中Caveolin-1、CD147、MMP-2mRNA水平均增加。Caveolin-1、CD147、MMP-2表达于体外培养的小鼠成釉细胞；封闭Caveolin-1的表达后，MMP-2mRNA和蛋白水平均下调， CD147mRNA水平略升高， HG-CD147（分子量42kD）蛋白水平显著降低。结论： Caveolin-1、CD147、MMP-2参与小鼠牙胚发育及成釉细胞的生物学过程；在体外培养的成釉细胞中，封闭Caveolin-1基因的表达可降低HG-CD147和MMP-2的表达。本研究为深入研究Caveolin-1在牙胚发育中尤其在成釉细胞生物学活动中的作用奠定了基础。