神经肽P物质及其受体在神经麻痹性角膜炎中的作用及机制研究

Neurotrophic keratitis is associated with corneal nerve damage, which difficult to treat in clinic. The research on it is limited to corneal epithelial damage and regeneration, and there is no report in corneal nerve and cornea immune inflammation. The applicant has been worked at Schepens eye institution of Harvard Medical School and established neurotrophic keratitis animal model. I also found that neuropeptide substance P (SP) changed obviously after nerve damage in neurotrophic keratitis. After back China I still insisted the basic research on nerve and immune association in neurotrophic keratitis under the supported of Prof.Hamrah and Prof.Yao Ke. In the two years research I confirmed the role of SP and its receptor NK1R on the keratitis. So the project will be based on pre experiment data of SP/NK1 in neurotrophic keratitis, which will focus on 1. We will study how SP/NK1 affects on neurotrophic keratitis in different time on the corneal ulcer recovery, corneal nerve regeneration and corneal immune inflammation, combination of NK1R knockout mice to establish neurotrophic keratitis, using gene injection or specific antibody antagonist technique. 2. We will study how neuropeptide SP regulating the immune cells and inflammatory molecules through regulating the NK1R receptor on DCs, using DCs depletion model and reinjection of NK1R co cultured DCs. The project will develop cross study of corneal nerve and cornea immunity. Information from this project could provide new molecular targets for in cornea neurogenic inflammation.

神经麻痹性角膜炎由角膜神经损伤导致，治疗棘手，目前研究局限于角膜上皮损伤修复，未有角膜神经及免疫炎症研究进展。申请者曾在哈佛实验室建立神经麻痹性角膜炎动物模型并发现神经损伤后神经肽P物质（SP）改变明显，回国后继续研究神经麻痹性角膜炎的神经免疫关联，并初步证实SP及其受体NK1R对角膜炎作用。本项目将在上述实验的基础上深入研究SP/NK1在神经麻痹性角膜炎中的作用机制，阐明1. 结合NK1R基因敲除小鼠建立神经麻痹性角膜炎，基因注射或特异性抗体拮抗，研究SP/NK1在神经麻痹性角膜炎不同时间点对角膜免疫炎症及角膜溃疡、神经修复的作用。2.通过树突状细胞（DCs）耗竭及回输SP/NK1R共培养的DCs，研究神经肽SP如何通过DCs上的NK1受体调控免疫细胞、炎症因子进而调控神经源性炎症的具体机制。本项目将为角膜神经及免疫的交叉研究奠定基础，为角膜神经源性炎症靶向治疗的开发及应用提供实验依据。

角膜神经系统与免疫系统之间存在大量的相互作用，我们此项研究主要关注于角膜丰富的三叉神经与免疫系统特别是巨噬细胞之间的双向交流机制及神经肽CGRP在其中所起的作用，从而开辟角膜炎的神经调控免疫治疗新方案。本项目在神经麻痹性角膜炎动物模型中发现单纯角膜感觉神经纤维的缺乏会引起角膜免疫稳态的破坏而产生炎症反应，在绿脓杆菌角膜炎动物模型中发现绿脓杆菌感染导致角膜神经密度降低，并且叠加去神经会加重绿脓杆菌感染的炎症反应，在这些过程中都出现CGRP的表达上调并与巨噬细胞存在免疫共定位。我们又从角膜炎动物中进一步分离三叉神经节，发现角膜炎症可以触发三叉神经节中免疫活化、感觉神经元激活以及小胶质细胞的激活和重组，从而证实眼部炎症促进三叉神经元敏化，而神经元的敏化在促进下游末梢神经CGRP的释放上扮演重要的作用，角膜炎症过程中免疫系统和神经系统之间存在双向交流机制。 随后，我们分离出三叉神经节感觉神经元并与Raw 264.7巨噬细胞进行共孵育。在接受LPS刺激后，感觉神经元介导的和巨噬细胞介导的CGRP释放均出现明显上调，当两种类型的细胞结合起来时将触发更多的CGRP释放，从而证实CGRP在神经-免疫对话中起着至关重要的作用，神经元细胞与免疫细胞（巨噬细胞）可以协同促进CGRP的释放。接下来我们又通过体内实验证明小鼠绿脓杆菌性角膜炎中抑制CGRP后角膜炎症加重，角膜促炎细胞因子表达增加；而体外实验在增加外源性CGRP后可以抑制巨噬细胞的炎症反应。体内外实验进一步证实CGRP可以通过PI3K / AKT信号通路抑制炎症并诱导巨噬细胞向抗炎M2表型的表型极化，从而有利于促进角膜炎症的消退。本项目通过上述研究确定了三叉神经与免疫系统在角膜炎症中存在神经-免疫对话，而CGRP在这种对话的协调中起着至关重要的作用。本项目的研究结果为角膜神经及免疫的交叉研究奠定基础，为角膜神经源性炎症靶向治疗的开发及应用提供实验依据，为临床角膜神经营养性角膜炎及感染性角膜炎的治疗开发新的神经系统调控方案提供研究基础。