利用TALENs技术制备myostatin基因敲除策勒黑羊的研究

Cele black sheep is a fecundity local breed, being prominent characteristic of high fecundity and annual estrus. However, meat performance of Cele black sheep is low and need to be further enhanced. Myostatin (MSTN) functions as a negative regulator of skeletal muscle development and growth. Mutation in the MSTN gene in mice results in an increase of meat performance by 200%, which provides a good animal model for enhancing meat performance of sheep by knockouting sheep MSTN. Therefore, this project will target MSTN gene of Cele black sheep and construct myostatin knockout Cele black sheep by optimal transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and somatic cell nuclear transfer technology. Meat performance and quality will be analyzed for myostatin knockout Cele black sheep. Our study will not only establish a new way for enhancing meat performance of sheep, which will lay foundation for breeding new strain of mutton and prolific sheep, but also establish a new technical route for gene knockout in the large mammals, which will lay foundation for constructing some important economic character of gene mutation sheep.

策勒黑羊是一个优良的多胎地方绵羊品种,其突出特征为全年发情和繁殖率高。然而，策勒黑羊的产肉性能较低，有待进一步改良。肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)是骨骼肌生长发育的负调控因子。MSTN基因敲除小鼠的肌肉重量大约增加了2倍，这为通过敲除绵羊MSTN基因，以提高绵羊产肉性能提供了很好的动物模型。因此，本项目以高繁殖力策勒黑羊MSTN基因为靶基因，采用转录激活子样效应因子核酸酶（TALENs）基因敲除技术，从各方面优化TALENs基因敲除条件的基础上，结合本实验室成熟的转基因克隆绵羊制作平台，构建MSTN基因敲除的策勒黑羊，并对该基因敲除策勒黑羊的产肉性能进行分析。本研究目标的实现，不仅将建立一条有效提高绵羊产肉性能的新途径，为培育肉用多胎绵羊新品种奠定基础，而且可探索一套高效的大动物基因敲除技术路线，为构建各种具有重要经济性状的基因定点突变绵羊奠定基础。

策勒黑羊是一个优良的多胎地方绵羊品种,其突出特征为全年发情和繁殖率高。然而，策勒黑羊的产肉性能较低，有待进一步改良。肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)是骨骼肌生长发育的负调控因子。MSTN 基因敲除小鼠的肌肉重量大约增加了2 倍，这为通过敲除绵羊MSTN 基因，以提高绵羊产肉性能提供了很好的动物模型。为利用最新的TALEN基因敲除技术制备MSTN基因敲除的策勒黑羊，本项目构建了2对TALEN基因敲除载体，测定发现TALEN载体活性达到87%和54%。优化了TALEN介导的基因敲除条件，筛选获得12株MSTN基因敲除的策勒黑羊成纤维细胞。优化培养了绵羊卵母细胞，进行体细胞核移植和胚胎移植实验。共胚胎移植78只受体绵羊，获得2只健康存活的羔羊。经DNA测序鉴定证实克隆羔羊的MSTN基因发生突变。经表型和组织学分析发现MSTN基因敲除绵羊的日增重显著高于对照绵羊，MSTN基因敲除绵羊平均肌纤维直径比对照绵羊平均肌纤维直径大。因此，MSTN 基因敲除绵羊的肌肉生长性能高于对照绵羊。同时，本项目还利用RNAi技术制备了MSTN基因沉默的转基因绵羊。本项目获得了MSTN基因敲除和基因沉默的绵羊，为最终培育具有自主知识产权的肉用绵羊新品种奠定基础。