基于ETS1/NF-κB通路诱导三阴性乳腺癌干细胞富集探讨复康灵协同紫杉醇增敏的机制研究

Among female malignant tumors, the incidence of breast cancer ranks first and shows an upward trend. Drug resistance is the main cause of recurrence and metastasis of breast cancer. Breast cancer stem cell enrichment is a key factor in drug resistance and disease progression. Professor Lin Yi, a famous veteran Chinese medicine, has developed Fukangling Formula on the basis of summing up the long-term clinical experience in the treatment of breast cancer and on the principle of benefiting Qi and strengthening the body. Previous clinical trials of our group have proved that Fukangling combined with neoadjuvant chemotherapy can improve the remission rate of patients with breast cancer; basic experiments have proved that Fukangling combined with taxol can promote the apoptosis of breast cancer cells and inhibit recurrence and metastasis. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is an important link in drug resistance. Previous studies have shown that ETS1/NF-kappa B is a key pathway mediating EMT and drug resistance in triple negative breast cancer (TNBC). Preliminary experiments also suggest that Fukangling containing serum can inhibit the activity of ETS1/NF-kappa B. The purpose of this study was to further explore whether Fukangling could reverse EMT by targeting ETS1/NF-kappa B pathway, which could lead to DNA damage of TNBC stem cells, and ultimately play a role in enhancing chemosensitivity. This study provides a molecular biological basis for Fukangling to reverse TNBC resistance, and further provides a scientific theoretical basis for the treatment of breast cancer with traditional Chinese medicine.

在女性恶性肿瘤中，乳腺癌发病率居首位并呈上升趋势。乳腺癌耐药是导致其复发转移的主要原因。乳腺癌干细胞富集是耐药发生和疾病进展的关键因素。全国名老中医林毅教授在总结长期诊疗乳腺癌临床经验基础上，以益气扶正为原则，研制出复康灵。课题组前期临床试验证明复康灵联合新辅助化疗具有提高患者肿瘤缓解率的作用；实验证明复康灵联合紫杉醇可多靶点促进乳腺癌细胞的凋亡及抑制复发转移。上皮间质转化（EMT）是耐药发生的重要环节。前期研究表明在三阴性乳腺癌（TNBC）中，ETS1/NF-κB是介导EMT并发生耐药的关键通路，预实验也提示复康灵含药血清具有抑制ETS1/NF-κB活性的作用。本研究旨在进一步探讨复康灵是否通过靶向抑制ETS1/NF-κB通路的活性，逆转EMT，进而导致TNBC干细胞DNA损伤，最终起到化疗增敏的作用。本研究为复康灵逆转TNBC耐药提供分子生物学基础，为中医药治疗乳腺癌提供科学理论基础。

肿瘤干细胞一直是临床和基础研究色重点和热点，而如何找到肿瘤干细胞并稳定用于基础研究一直是研究的难点。本研究通过3D微球诱导实验SUM149所得到乳腺癌干细胞149-BCSCs，通过MTT实验验证对紫杉醇的耐药指数是12.45，达到中等耐药水平。进一步通过凋亡验证其耐药水平。为解决肿瘤干细胞这一难题给出了较好的解决方案。同时本研究用复康灵含药血清干预乳腺癌干细胞149-BCSCs，明显抑制肿瘤球的体积生长；同时通过MTT检测发现，耐药指数为4.35。运用荧光染色验证发现乳腺癌干细胞CD44的表达量下调，而经过复康灵干预后，ETS1和P65两者的表达水平下调，体内实验表明复康灵联合紫杉醇具有增敏的作用及降低EMT的表达水平,但未能促进DNA损伤。.国医大师林毅教授结合自己50年治疗乳腺癌临床经验，研制出具有以扶正为主作用的“复康灵”胶囊（原名“癌复康”）。前期临床研究发现:复康灵胶囊具有增强新辅助化疗疗效的作用。但是其具体机制一直未被阐明。本研究应用网络药理学方法筛选中药复方复康灵的活性成分以及作用于三阴性乳腺癌干细 胞的作用靶点及通路，探讨其分子机制。通过TCMSP数据库、TCMID数据库和BATMA、N-TCM数据库筛选出复康灵活性成分及其相关靶标；通过GeneCards数据库以及GEO数据 库收集疾病相关基因做交集筛选目标基因；运用String11.0数据库构建蛋白互作网络图 （PPI）；采用DAVID数据库对复康灵关键作用靶点进行基因本体论（GO）和京都基因与 基因组百科全书（KEGG）分析。通过筛选得到复康灵有效成分108个和对应的靶基因446个，与三阴性乳腺癌干细胞疾病基因交集为49个；GO结果显示复康灵活性成分的基因功能发挥抗三阴性乳腺癌复发转移主要是调控细胞增殖、迁移等生物过程；KEGG结果显示主要通过调控NF-kappa B信号通路等发挥治疗作用。本研究预测了复康灵对乳腺癌干细胞的作用靶点及其有效物质基础和分子机制，阐释了复康灵对乳腺癌转移的分子基础。.为了验证复康灵其中药成分豆甾醇的抗三阴性乳腺癌肿瘤干细胞的活性，本课题从体内和体外表型验证，同时JAK3调节肿瘤干细胞关键靶点，提过改变的表达水平，进一步得出复康灵主要活性成分豆甾醇通过JAK3抑制了三阴性乳腺癌干性。